微图案:微控制细胞的艺术

研究体外活细胞的挑战

像所有生物一样，细胞对影响其行为和发育(细胞分化、增殖、迁移等)的环境非常敏感。事实上，一些研究表明，癌症生长或干细胞分化等机制不仅由遗传诱导，也由细胞环境诱导[1,2]。然而，它在生物化学、结构或相互作用方面的复杂性解释了在体外研究活细胞时所面临的困难。除了这一生理相关性问题，研究人员还面临着许多其他挑战，例如重复出现的可重复性问题、易用性和效率，在高通量的情况下更是如此。

在用于解决这些问题的实验工具和技术中，有一种是微模式:一种在机械生物学中经常使用的方法，被称为活细胞细胞内和细胞间机制的体外分析。但是，微模式不仅局限于机械生物学，它还可以成为不同研究领域的强大资产，比如疾病建模、免疫学、毒理学。最近，它也成为了冷冻电子断层扫描(cryo-ET)这一前景广阔领域的必备技术:一种基于冷冻电子显微镜(cryo-EM)的技术，可以对闪冻细胞中的大分子复合物进行成像，从而更好地了解它们在原生状态下的作用。
本文将探讨微模式在细胞生物学研究中的好处，然后对新兴的全细胞冷冻et领域进行研究。
微图案化是指生物分子在微米尺度上的可控沉积，旨在模拟或控制细胞生化微环境。大约30年前，它首次用于细胞生物学研究，研究细胞形状(利用黏附蛋白局部控制细胞黏附和形状)与终端分化[3]之间的联系。从那时起，微图案化已被常规用于证明细胞粘附、细胞形状和细胞内组织之间的联系[4,5]。
多年来，不同的微模式技术已经被开发和改进，首先是由学术研究实验室，然后是工业公司，以扩大其使用范围，促进其使用并保证可重复的结果。目前，两种最常用的微模式化方法是使用弹性体邮票的微接触印刷和通过掩模[6]的深紫外光刻。然而，这些方法缺乏一些现在通常被认为是强制性的功能，包括图案形状的灵活性、多基片的兼容性(由于越来越多地使用软基片或微结构基片)以及在这些基片上的对齐;在很长一段时间内，这些限制限制了微图案在普通平面衬底上的使用。
此外，细胞生物学实验的复杂性增加导致底物的多样性增加，由于其材料组成、低刚度或微观尺寸，底物的脆弱性也增加。这种脆弱性的一个典型例子是用于全细胞冷冻电子断层扫描[7]的电子显微镜网格(EM网格)-直径约3毫米的圆形衬底，由金属网格和约20至50纳米厚的碳层薄膜组成。
最近，一种微图案化解决方案似乎通过防止与衬底的直接接触来解决所有这些设计灵活性、对齐和表面保护的问题。这一创新系统是由Alvéole开发的PRIMO®无掩模光模系统，Alvéole是法国国家科学研究中心(CNRS)的一个分支，于2010年获得资助，其机制将在本文中介绍。

微模式工作流程:排斥和吸引的结合

所有的蛋白质微图案技术都依赖于使用粘连蛋白(如纤维连接蛋白或层粘连蛋白)形成的粘附斑块(微图案)，以及由于防污涂层而产生的排斥区域。防污涂层的质量——经典的聚乙二醇(PEG)聚合物——对于确保蛋白质和细胞微图案的质量至关重要，就寿命和形状精度而言。事实上，当播种时，细胞不能粘附在驱蚊表面，而只能粘附在微图案上。

微模式技术的例子包括:
1.微触印刷
对于这种方法，必须使用光刻、掩模和光阻剂对具有所需微特征的邮票进行微加工，以生成显示未来微图案设计的母版。然后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)倒在母版上并固化以创建印章(与初始母版相反的复制)。这种邮票的“墨水”是一种粘附蛋白溶液。然后用防污层回填非图案区域。这种微图案技术是使用最频繁的技术，也被认为是最简单的(如果从供应商那里购买戳记，而不是自己制作戳记)，但它也是最不精确的技术。事实上，邮票柱边缘的锐度，施加在邮票上的压力和蛋白质沉积量的差异，都是最终影响最终微图案质量的可变因素。当然，在微观尺度上，邮票在特定微观结构上的排列构成了一个真正的挑战。

2.深紫外光刻和掩模
光掩模深紫外光刻技术的优缺点与其工艺直接相关。在所需的细胞培养基质上涂上防污聚合物后，在其上放置一个掩模，这是一种坚固而不透明的模板，上面穿孔有所需的微观形状。然后，深紫外光照射到掩模的顶部，以降解与掩模中的孔匹配的区域上的PEG层。然后添加基于溶液的粘附蛋白，并吸附到先前照明的区域。在这里，通过直接接触对软基板造成的对准问题和可能的损坏似乎很明显。但是，当这项技术执行良好时，它具有产生大量相同的微图案的优势。然而，这种微图案生产的效率只有在微图案设计之前针对特定的实验和细胞类型进行了优化时才有价值。否则，需要订购新的掩模，延误了项目的进度。

3.无掩模和无接触式光刻
2016年，法国波尔多大学的Vincent Studer博士团队提出了一种基于数字微镜设备(DMD)的新微图版方法，该设备也用于视频投影仪，他们将其称为光诱导蛋白质分子吸附(LIMAP)[8]。从那时起，这项技术已经被Alvéole作为PRIMO设备进行了改进和商业化。
PRIMO是一种光学模块，其主要组件是DMD和UV源(λ = 375 nm)。这个模块可以安装在所有最常见的倒置显微镜上。一个专用的软件程序(名为“Leonardo”)允许选择、校准、调整和复制一个或几个所需的最小分辨率为1.2微米的微图预览，在置于显微镜机动级的细胞培养基质上。一旦设定了微图案化序列，该软件启动PRIMO，将紫外光投射到先前涂有防污层的基板上，并存在特定的光引发剂(PLPP)。UV和PLPP的联合作用可在短短几秒钟内局部降解防污涂层。然后加入蛋白质，只吸附在被照亮的区域，形成微图案。
作为一种无掩模和非接触式系统，PRIMO系统解决了灵活性、对齐、基板完整性和效率等问题，提高了原型设计和优化能力。事实上，微图案图像可以投影在任何标准的细胞培养基质上(硬的或软的，平面的或微结构的，大的或微观的)，并测试以获得每个特定实验的最佳蛋白质微图案。此外，作为一种光刻技术，PRIMO还可以用于制造3D微结构衬底(微加工和水凝胶聚合)，在一个独特的工具中结合了结构和功能化能力。
图3。PRIMO微图案平台。来源:肺胞。

微图案:细胞生物学的一种花哨的工具还是真正的资产?

生物工程和生物功能化底物的最新进展为提高我们对细胞过程、细胞外基质作用和相关疾病的理解和质疑提供了新的机会。根据科学问题的复杂程度，细胞生物学研究在不同的尺度上进行，从单细胞到小细胞组合、组织，几年后再到类器官。
即使微图型可用于生成球体和分析细胞群体力，它也最适用于研究细胞骨架、牵引力、细胞迁移或疾病建模，这些研究往往需要分离单细胞或精确控制细胞-细胞相互作用。许多关于细胞力和疾病建模的实验都是在软基质上进行的。在这里，毫无疑问，非接触式微图案系统PRIMO是该领域的一个真正的优势，因为它与低刚度衬底兼容;东北大学的Parameswaran博士团队在研究气道平滑肌细胞收缩时，使用了0.3 kPa至40 kPa[10]不等的不同硬度凝胶的微图版。这项创新技术的另一个独特好处，尚未讨论，是能够局部控制蛋白质密度和产生梯度;使其成为研究趋化机制或免疫反应的有力工具。越来越多的研究项目使用这种无掩模、无接触技术证实，研究人员需要通过使用这种技术继续提高他们对体外细胞微环境的控制能力。

低温电子断层扫描:完美样品的挑战

Alexander Rigort在2012年发表在《美国国家科学院院刊》(PNAS)上的论文中表示:“低温电子断层扫描技术为接近生命状态下细胞的大分子和超分子组织提供了前所未有的见解。”事实上，冷冻电子断层摄影术已经被证明是显微镜学的一大进步，可以更好地观察和理解细胞内和细胞间的原生状态和分子水平机制，例如病毒感染机制。
图5。从栓系蛋白酶体到核孔复合体的研究的层析图。由Max Planck生物化学研究所的Ben Engel博士提供，Martinsried，为徕卡微系统

但冷冻et仍然是一种年轻的显微镜技术，其工作流程的所有步骤都正在受到学术实验室和工业公司的严格审查和改进。几乎工作流程的每一步都是至关重要的，但对于真核细胞，在考虑进行显微镜检查之前，细胞样本必须满足一些基本要求:匹配EM网格上的特定位置，包含目标成分，并且足够薄，可以进行透射电子显微镜检查。
冷冻et的理想厚度估计在200纳米左右。作为比较，根据细胞类型的不同，随机分布在平面上的真核细胞的厚度范围可以在0.5µm(胞浆体和薄片足)到10µm(细胞核周围的细胞中心)之间。
通过控制细胞的粘附，扩散和形状，微图案克服了这个工作流程的第一步所面临的问题。事实上，如果没有微图版，培养基中的细胞会被随机地播种到EM网格上，并且倾向于粘附在网格的金属网格上，而不是碳膜上，从而在进行透射电镜时阻止电子穿过它。此外，细胞的随机播种也与有限的扩散相关，使得由于厚度的原因更难找到目标。相反，微模式可以控制它们的位置和细胞扩散的增加，因此便于低温et细胞样品制备的下一步。然而，由于EM网格的尺寸和精细性，用掩模进行微接触印刷和光刻是非常困难的，如果不是不可能的话。
几个研究团队最近成功地使用非接触式PRIMO微图案系统在EM网格上绘制了细胞微图案，并发表了他们的结果，显示出与其他微图案技术相比无可比拟的性能。他们能够为冷冻et实验制备更好的细胞样本，细胞分离良好，位于所需位置[14]，并强调微模式对细胞骨架组织的影响可以帮助预测一些细胞骨架成分的细胞内位置，提高数据采集的通量，从而实现更有效的冷冻et研究[15]。
将这种新的微模式方法集成到冷冻et细胞样品制备的持续改进中，包括冷冻冷冻，相关光学显微镜，冷冻fib薄片铣床，由Alvéole和徕卡微系统合作发起，将很快加速在分子尺度上细胞机械真正发生的研究突破。

参考文献

1.比塞尔先生，拉巴奇先生。背景、组织可塑性和癌症:肿瘤干细胞也受微环境调控吗?中华癌症杂志，2005,7(1):17-23
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8.P-O斯特拉尔，阿齐昂，G布尼古，Y勒孔特，M查希德，V斯图特。光诱导分子吸附多蛋白打印技术。植物学报，2016,28(10):2024-9。
9.V Ruprecht等。细胞如何对环境线索作出反应——来自生物功能化基质的见解。中国生物医学工程学报，2017,30(1):531 - 531。
10.S R脊髓灰质炎等。细胞外基质刚度通过改变细胞-细胞耦合来调节气道平滑肌收缩。2019年,9(1):9564。
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12.Alvéole用户的科学论文:https://www.alveolelab.com/resources-support-center/scientific-papers/
13.恩格尔等人。全细胞低温电子显微镜研究的细胞外基质微图案化技术。微机械微工程学报，2019,29(11):115018。
14.M Toro-Nahuelpan, L Zagoriy, F Senger, L Blanchoin, M Théry, J madhamid。通过光微图案化剪裁冷冻电子显微镜网格用于细胞内结构研究。物理学报，2020,17(1):50-54。
15.恩格尔等人。电子显微镜栅格微图案化用于提高细胞冷冻电子断层扫描通量。BioRxiv 2020