用低温电子断层扫描技术了解宇宙内部

我们做的每一件事，从动动手指到思考和记忆的形成，都会在大脑和身体中触发信号级联。神经递质(NTs)从突触(神经元之间的神经末梢，信息在这里从一个神经元传递到下一个神经元)释放到突触间隙(神经元之间20-30纳米的空间)，并到邻近细胞的起点(称为突触后)(图2)。
如果涉及到运动，最终来自大脑的信号将到达指定的肌肉细胞，指示它收缩，这可能导致，例如，手指的运动。有关手指新位置的信息将立即从受体神经元发送回大脑，以检查是否达到了预期的结果，或者是否需要进行任何修正。
如果我们想了解大脑和神经系统是如何受到疾病、损伤或精神健康状况的影响，就必须研究它的精细结构和功能。高分辨率显微镜技术在这一探索中发挥着至关重要的作用;它们对于可视化开发治疗所需的细节非常重要。

在过去，大脑细胞在经过脱水和化学染色固定后进行研究，以保存特定状态下神经元大结构的快照。然而，这意味着精细的细节丢失了，比如提供细胞间交流的突触中的小蛋白质丝。这些结构被称为系索和连接器，将一个囊泡连接到另一个囊泡。研究这样的小蛋白质很重要，因为它们经常在神经退行性疾病中受到影响。

冷冻电子断层扫描(cryo-ET)使我们能够非常详细地研究神经元和连接器等独特的物体，而不需要化学染色和脱水。
低温em和低温et是如何工作的?

低温电子显微镜(cryo-EM)是低温电子显微镜的一个分支。该方法的名称强调了样品是在非常低的温度下研究的，通常在-196°C。在这个温度下，水(占所有生物体内90%以上的含量)可以以无定形的非结晶形式存在，这种形式也存在于深空彗星中。
在低温em样品制备过程中，通过将样品快速浸入液态乙烷中，样品中的水变成非晶态冰(称为玻璃化)，液态乙烷被液氮冷却到大约-172°C。生物样品的玻璃化速度如此之快，以至于阻止了冰晶的形成，结构的完整性被保存下来，就像它们仍然在自然环境中一样。由于玻璃状冰可以在-156℃以下的电子显微镜真空中保存，在样品制备和研究过程中没有发生干燥，因此样品被称为冷冻水合状态保存。
在低温et中，可以通过结合不同角度采集的样品的多个投影来构建独特样品的三维(3D)模型。在医学断层扫描中，电子可以以与x射线相同的方式穿过样本，但由于电子是带电的，电磁透镜可以用来创建一个非常小的物体的详细放大图像，使我们能够探索亚细胞分子结构的宇宙([1]中有回顾)。
此外，通过对细胞进行各种化学和物理刺激处理，然后在处理后拍摄快照，人们可以潜在地研究微小的变化。这使得我们能够了解细胞的功能，从而能够创建一个动态的4维(4D)细胞过程模型。
Cryo-ET以样品的高分辨率(~ 1-4 nm) 3D视图的形式产生纳米级信息，通常是生物大分子和细胞。该技术非常适合研究原生细胞环境中较厚的细胞标本，但最佳样品厚度低于300 nm。
为了解开较厚样品的细节，发明了在双束扫描电子显微镜(SEM)中通过聚焦离子束铣削进行减薄(冷冻fib SEM)。细胞的薄片可以用冷冻et[1]建立3D模型。英国电子生物成像中心(eBIC)的科学家在钻石光源应用了这项技术，雷电竞网址有助于揭示全球Covid-19大流行开始时SARS-CoV-2的生命周期(图1)[2]。

学习神经科学的冷冻em和冷冻et技术

我对高分辨率显微镜的兴趣是在德国慕尼黑马克斯·普朗克心理学研究所(Max Planck Institute of Psychology)攻读理学硕士学位(MSc)后发展起来的。我想更彻底地了解大脑的结构，所以我研究了哪些显微镜可以达到更高的分辨率，并发现了令人兴奋的新技术，比如冷冻电镜(cryo-EM)，这是一种获得2017年诺贝尔奖的高分辨率成像技术。
2012年，我搬到了瑞士伯尔尼的解剖学研究所，攻读博士学位，并做了一段时间的博士后研究。他的博士学位是通过冷冻et研究突触小体中的突触囊泡胞吐(从神经末梢上掐下来)，这是另一种当时仍处于初级阶段的技术。
我真的很喜欢细胞断层摄影术，因为细胞内有许多有趣的东西吸引眼球，让你想知道它们可能是什么。这让我想研究细胞内的所有过程，但不幸的是，时间有限!
学习惊人的冷冻et技术，开发和改进方法，以实现毫秒分辨率的雾化器，最初由Berriman和Unwin[3]使用，并分析断层图上的突触囊泡和相反的活性区质膜的最小变化是非常有趣的。我也有机会在蛋白质生物化学、细胞培养和冷冻电镜处理相关样品制备方面扩展我的知识，以及学习冷冻fib。最终，我的目标是通过低温光和电子显微镜研究正在进行的细胞过程。
为了更深入地研究神经科学，我从瑞士国家科学基金会获得了早期职业博士后研究资助，于2017年加入丹麦哥本哈根的一个实验室。我最初学习了电生理学和嗜铬细胞制备，但后来转向了原代星形胶质细胞和神经元细胞培养。
在研究疾病如何影响大脑功能之前，了解健康神经元中的神经递质释放(突触囊泡(SV)胞吐或信号转导)-涉及哪些蛋白质以及释放过程中发生了什么-是必要的基础。
突触包含充满信号分子的突触囊泡。我们的研究着眼于突触囊泡胞吐的功能方面，以了解哪些蛋白质参与其中，以及当某些蛋白质通过基因缺失被敲除时会发生什么。

试图在EM网格上生长神经元是一个挑战

最终，我成功地建立了一种在EM网格上生长神经元的方法，这种方法也产生了许多具有突触后突触的薄功能突触(图2)。在正确的护理和条件下，在网格上生长初级神经元可以很简单，但在网格上获得足够薄的功能突触(意味着突触、间隙和突触后)并不容易。

研究大脑，Sars-CoV-2疫苗研究，并支持eBIC显微镜用户

2019年，我开始在eBIC担任电子显微镜高级支持科学家。我以前的经验——特别是在低温et方面的经验——让我为这个角色做好了准备。
我大约70%的时间专注于支持英国和世界各地的用户给我们寄样品。我帮助他们进行实验设置，如数据采集策略，样本准备，并就需要改进的地方提出建议。除了我们自己的项目外，我们还从事其他项目。
例如，在Covid-19大流行开始后，我们投入了所有资源，帮助研究Covid-19病毒，以战胜疾病。我们研究了病毒突刺蛋白，并研究了细胞样本，看看第一批正在开发的疫苗在细胞中起了什么作用。
利用单粒子低温电镜研究从病毒本身分离出的刺突蛋白，以揭示刺突的结构[4]和低温et进行细胞研究。通过了解刺突如何进入细胞以及它使用的结构，可以开发出特定的药物来干扰结构以防止细胞进入[2]。此外，Diamond还采用了其他先进的x射线成像和衍射技术。将软x射线成像与冷冻et和串行聚焦离子束扫描电子显微镜相结合，可以描述SARS-CoV-2感染的详细图像[Mendonca等人[2]]。x射线晶体学提供了高分辨率的结构数据，可用于加速药物发现过程，并在Diamond成功地用于理解，例如，关注的变异如何从自然或疫苗诱导的免疫中逃脱[参考文献- Stuart等人的细胞论文[5]]。
我在eBIC的另外30%的工作是研究我自己的项目，通过研究大脑结构和功能之间的关系来更好地了解大脑。在一个健康的系统中理解这一点可以改善我们对疾病或精神健康状况影响的系统的理解，从而开发治疗方法。我得到了一名一年的工业学生的协助，他们从事初级神经元培养和获取断层摄影来研究突触内的小蛋白质。

我们采用一系列高分辨率显微镜技术，使用eBIC的最新技术。我发现尽可能多地了解显微镜的技术细节是很有趣的。这是伟大的故障排除显微镜挑战一起在钻石的工程师，以及学习如何解决一些更容易的问题自己。最近，我发现自己在一个塔洛斯北极TEM的盒子里，试图找到一根需要拔下来重置连接的特定电缆!

高分辨率显微镜-需要什么经验和资格?

有动力去学习显微镜的物理/光学特性对于更深入地了解显微镜和如何操作它们是有用的。
以我为例，我进入我的研究领域时具有一般生物学背景，专门研究神经科学。在攻读生物学本科学位期间，我参加了为期两周的显微镜强化课程，在此期间我学习了如何使用光学显微镜(LMs)。在我的硕士项目期间，我发展到使用共聚焦LM，并在我的博士项目期间转移到EM。
现在我教一个理学学士三年级的EM和神经科学。她非常积极，渴望学习如何操作显微镜和如何生长神经元的所有细节。
在Diamond，有几个x射线设备可以用于研究相同的问题，但在不同的尺度上，从使用断层扫描或相干成像来成像更大的体积，或者使用光谱技术来研究细胞内的化学成分。无论是在戴蒙德还是与校园内的研究机构，都有很多合作的机会。由于工作环境愉快、灵活，在EM领域以及其他领域和技术都有很大的发展和进步空间。为了亲身体验这些技术并发现更多，在Diamond有很多职业选择，如申请一年的行业，暑期实习或博士学位。
最终，一个人需要有好奇心和学习新事物的动力，同时愿意适应思想和观点。只要心态正确，总会有适合自己的角色。

参考文献

1.Turk, M.和Baumeister, W.(2020)，冷冻电子断层扫描的前景和挑战。财经学报，594:3243-3261,https://doi.org/10.1002/1873-3468.13948
2.Mendonça L, Howe A, Gilchrist JB, Sun D, Knight ML, Zanetti-Domingues LC, Bateman B, Krebs AS, Chen L, Radecke J, Sheng Y, Li VD, Ni T, Kounatidis I, Koronfel MA, Szynkiewicz M, Harkiolaki M, Martin-Fernandez ML, James W, Zhang P.相关多尺度冷冻成像揭示SARS-CoV-2组装和出口。Nat Commun 12, 4629 (2021)， https://doi.org/10.1038/s41467-021-24887-y
3.John Berriman, Nigel Unwin，用低温显微镜结合快速混合喷雾液滴分析瞬态结构，超微显微镜，第56卷，第4期，1994年，第241-252页，ISSN 0304-3991, https://doi.org/10.1016/0304-3991(94)90012-4
4.Dejnirattisai, W.， Zhou, D.， Ginn, H. M.， Duyvesteyn, H. M.， Supasa, P.， Case, J. B.， Zhao, Y.， Walter, T. S.， Mentzer, A. J.， Liu, C.， Wang, B.， Paesen, G. C.， Slon-Campos, J.， López-Camacho, C.， Kafai, N. M.， Bailey, A. L.， Chen, R. E, Ying, B.， Thompson, C.，…，Radecke J.，…SARS-CoV-2受体结合域的抗原解剖，细胞，第184卷，第8期，2021年，第2183-2200页。e22, ISSN 0092-8674, https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.032 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286742100221X)
5.Stuart等人:通过疫苗和恢复期血清降低SARS-CoV-2 B.1.617的中和DOI: 10.1016/j.cell.2021.06.020 2021年6月;对SARS-CoV-2 Beta的抗体反应强调了与其他变体的抗原距离DOI: 10.1016/j.c om.2021.11.013 Nov 2021;SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529导致中和抗体反应广泛逃逸DOI: 10.1016/j.cell.2021.12.046 2022年1月
电子生物成像中心:https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/eBIC.html
Diamond Light Source的职业选择:https://www.diamond.ac.uk/Careers.html
图1图片改编自[2]Nat Commun 12,4629 (2021)， https://doi.org/10.1038/s41467-021-24887-y。根据创作共用许可协议转载:http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。