利用MS/MS和微流LC提高农药残留分析的灵敏度，减少基质效应

对69种常用农药的微流色谱分析与分析流色谱进行了比较。对所有69种农药的敏感性都有所增加。QTRAP 6500+系统上的OptiFlow Turbo V离子源可实现更敏感的环境方法。它可以在检测下限的环境监测工作中发挥关键作用。

液相色谱(LC)已应用于广泛的环境样品，将其与串联质谱(MS/MS)相结合，可以实现高度敏感和准确的测量[1]。大多数LC-MS/MS方法依赖于电子喷雾电离(ESI)，该方法容易受到基质效应的影响，包括离子抑制[1]。然而，ESI的多功能性和使用该方法可以分析的环境问题化合物的广泛范围使LC-MS/MS成为环境研究和监测的关键工具。随着LC-MS/MS成为分析非挥发性污染物和极性污染物的更重要工具，研究的重点是创建更灵敏的方法。微流LC已被证明可获得灵敏度增益，但直到最近，由于这些特殊测定的灵敏度要求，主要用于肽LC-MS/MS定量。
与传统的高性能分析LC系统相比，微流LC的流速显著降低，通常在1 - 200µL/min[1,2]。由这些低流速引起的灵敏度增加有几个原因。首先，基于大气压的质谱仪在较低的流速下具有更高的离子采样效率。随着离子采样技术的最新进展，微流和纳米流分析(< 1 μ L/min)之间的灵敏度差距正在缩小(图1)[3]。这使得微流色谱极具吸引力，因为它可以提供显著的灵敏度增益，而不需要极高的鲁棒性，低样品容量和低通量的纳米流色谱。除了采样容量外，微流速产生的更小液滴允许ESI产生更多的离子。此外，通过减小这些液滴的大小，离子抑制效应可以最小化，因为有更少的分子竞争电荷[1]。这对于食物和环境基质极具价值，因为这些基质是出了名的复杂，即使使用了广泛的样本提取技术[2,4]。
图1。电喷雾取样效率在流速上有4个数量级。
当MS采样容量从2.8 L/min(蓝色迹线)增加到4.0 L/min(橙色迹线)和16 L/min(灰色迹线)时，在给定的LC流速下可以观察到离子采样效率的增加。此外，随着MS采样容量的增加，在纳米流区(< 1µL/min)和微流区采样效率之间的差距逐渐缩小。使用权限为[3]的图形。
本文对69种常用农药的微流LC和分析流LC进行了比较。

方法

本研究的主要目标之一是比较微流动和分析流动HPLC方法结合MS/MS。为了做到这一点，两种方法之间的参数尽可能保持一致。两种方法中化合物特异性的MS/MS条件保持一致。仅对气源和气体条件进行了适当的流量优化。数据处理采用SCIEX OS 1.7软件。HPLC柱的化学性质和粒度也保持不变。只改变每种流速所对应的柱尺寸。
高效液相色谱分离使用LC系统(ExionLC AD, SCIEX)，配备两个双泵(LC- 30ad, SCIEX)和一个柱式烘箱(CTO-30A, SCIEX)。色谱柱为Luna Omega 3µm Polar C18 100 Å 100 × 4.6 mm (Phenomenex)，温度维持在45℃。梯度条件概述在表1中。进样量为1 μL。采用QTRAP 6500+系统和IonDrive Turbo V离子源对提取的样品进行分析。
微流分析采用微流LC系统(M5 MicroLC, SCIEX)，流速为15µL/min。相同的固定相用于较小直径的色谱柱(Luna Omega 3µm Polar C18 100 Å 100 x 0.5 mm, Phenomenex)。梯度条件概述在表2中。直接注入1µL样本量。使用相同的流动相，但梯度为低流速进行了优化。样品分析使用相同的QTRAP 6500+系统，配备了专门为低流速设计的OptiFlow Turbo V离子源。
表1。比较用于微流和分析流LC的梯度。
分析流量(800µL/min)微流量(15µL/min)
Time %B时间(分钟)%B
0 55 0 0
0.5 55 1 10
2.5 80 5 40
8.5 90 7 80
12.5 100 9 100
16.5 100 16 100
16.6 55 16.10

流动相A: 100%水+ 0.1%甲酸，5mM甲酸铵
流动相B: 100%乙腈+ 0.1%甲酸，5mM甲酸铵

微流与分析流LC的灵敏度比较

通过将微流动方法所得化合物的信噪比(S/N)除以分析流动方法所得化合物的信噪比(S/N)，比较了微流动与传统分析流动LC的灵敏度。该比值在两点处测量:(1)分析流量数据中校准曲线的最低点和(2)微流量校准曲线的最高点(图2)。之所以使用分析流量数据的最低点，是因为微流量方法提供的校准曲线点低于分析流量方法的LOQ。使用微流校准曲线的最高点，因为检测器和源饱和首先出现在微流LC数据中。低点和高点校准点都是化合物依赖的。
在低浓度处，所有69种化合物的S/N均有增加。超过一半的化合物的S/N增加超过10倍(图2，绿色)。此外，在微流动数据法中观察到在分析流动法中未观察到的三种化合物:甲基对硫磷、氯虫腈和阿维菌素B1b。在低点的平均S/N改善为29，标准差为39，中位数为12(图3，绿色)。在图3中观察到的三个异常值是敌敌畏、三氯羟肟菌酯和联苯菊酯，微流量S/N增益分别为239、143和95。
可以注意到，在校准曲线的低点处S/N的改善接近或在某些情况下大于原始区域观察到的增益(图3)。随着流速降低，来自溶剂杂质的背景离子减少，这通常会导致化学噪声减少，从而进一步增加S/N。
图2。微流和分析流LC之间的信噪比(S/N)增益。在这里，S/N是在分析流量数据(绿色)和微流量数据最高点(紫色)的LLOQ处进行比较的。所有被分析的69种化合物的S/N均高于其LLOQ下的分析流。许多化合物的信噪比显著提高了5倍或更高。
在微流曲线的高浓度处，比较了微流与分析流的S/N比。在所有化合物中，28种化合物的S/N改善超过10倍(图2，紫色)。平均高标准S/N比为14，标准差为23，中位数为7(图3，紫色)。观察到的7个异常值分别为氟虫腈、氯氰菊酯、敌敌畏、棘菌素D、刺冬菊酯、磷磷酯和吡虫啉，其比值分别为110、110、85、55、52、47和37。
图3。微流动与分析流动HPLC的信噪比增益比较。再次比较了每种化合物在低浓度(绿色)和高浓度(紫色)点之间的S/N比。每种化合物的S/N增益都有一定范围，但大多数化合物都有S/N增益。在低浓度点，还比较了微流和解析流之间的峰面积(橙色)。
可以注意到，在校准曲线的低点处，信噪比的改善接近或在某些情况下大于在原始区域观察到的增益(图3)。这突出表明，微流色谱提供的信号改善往往伴随着噪声的可忽略不计的变化。MRM色谱图的例子突出了在微流LC实验中观察到的信号增益和信噪比增益(图4)。
图4。比较两种不同流动状态的色谱图示例。对四种农药进行微流液相色谱(蓝色)和传统分析流动液相色谱(橙色)比较的MRM色谱图显示:A) spininosyn D, B) imidacloprid, C) coumaphos。

敏感度增加的原因

我们观察到，原始信号和S/N的增益分布都比单靠采样效率的提高所能描述的要大(图1)。研究了几个因素来确定灵敏度增加的原因，包括pKa、Log P、极表面积和温度灵敏度。进行肯德尔等级相关分析以确定显著相关性。研究发现，在微流量下，温度敏感性对S/N的改善影响最大。电离过程中的最佳液滴脱溶通常发生在高温和气流中，但一些化合物容易热降解。由于微流源条件通常需要较低的温度和气体流量来获得最佳灵敏度，因此这些温度敏感化合物不太容易热降解，性能得到了增强。
为了确定化合物的温度敏感性，在一系列源温度下注入一个包含所有农药的标准，从350°C到550°C，以50°C为增量。然后根据源温度绘制面积，并使用线性回归模型计算斜率。这条线的斜率被用来表示化合物的温度敏感性。该线的斜率与敏感性的增加呈显著相关。
为了进一步评估这种关系，将化合物分为两组:(1)斜率为负且r2大于0.7的化合物，(2)斜率为正且r2大于0.7的化合物。随着源温度的降低，斜率为负的化合物的面积增加。相比之下，在较高的源温度下，具有正斜率的化合物的面积增加。结果发现，受益于较低温度的化合物的中位数比受益于较高温度的化合物高~4倍(图5)。
图5。源温度对农药信号的影响。比较了观察到的两类化合物的微流和分析流在低浓度点的信噪比(S/N):那些在较低的源温度下看到强度增加的化合物(红色)和那些在较高的源温度下看到强度增加的化合物(蓝色)。

结论

对69种常用农药的微流色谱分析与分析流色谱进行了比较。所有69种农药在浓度曲线低点处的敏感性都有所增加。观测到的S/N增加的主要因素是温度敏感性。对温度敏感的化合物的信噪比有较大的增加。M5 Microflow LC系统与OptiFlow Turbo V离子源相结合，可实现更敏感的环境方法。它可以在环境和食品监测工作中发挥关键作用，因为需要降低检测下限(LOD)来保护公众健康。

参考文献

1.Uclés Moreno A等(2015)微流液相色谱耦合质谱-一种在农药残留分析中显著提高灵敏度、减少基质效应和减少有机溶剂使用的方法。分析的化学学报，37(2)，337 - 337。
2.Herrera López S, et al.(2016)蜜蜂蜡梳中农药残留的LC-ESI-MS/MS筛选。初步研究。Chemosphere 163,44 - 53。
3.Schneider, Bradley B，等(2021)电喷雾电离质谱仪的采样效率提高及其对液相色谱进气系统的影响，流量范围为纳升至毫升/分钟。j。Soc。质谱仪，2017,32,6,1441-1447
4.Gil García MD，等人。(2017)MCM-41作为新型固相吸附剂用于环境水中农药的预浓缩和微流液相色谱-四极杆线性离子阱质谱测定。Microchem。J. 134, 181-190。

作者信息

Robert A. Di Lorenzo博士，加拿大多伦多SCIEX食品和饮料测试全球技术专家，Karl Oetjen博士，美国科罗拉多州SCIEX北美大麻、环境和食品和饮料测试高级应用科学家。
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