干细胞技术的当前和未来创新

干细胞101

构成人体器官和组织的每一种细胞类型都是由一种叫做干细胞的更原始的细胞类型产生的。干细胞是生物体的基础，具有自我更新和分化为特化细胞类型的独特能力。有三种不同类型的干细胞，根据它们能产生的特化细胞类型的数量来分类:i)多能干细胞(如胚胎干细胞)可以产生任何特化细胞类型;多能干细胞(如间充质干细胞)能够产生多种但不是全部的特化细胞类型;iii)单能干细胞(例如产生皮肤的表皮干细胞)只产生一种细胞类型。长期以来，人们一直认为干细胞分化为特化细胞类型只发生在一个方向上。干细胞生物学已经取得了许多令人兴奋的进展，最值得注意的是诱导多能干细胞(iPSCs)的发现，证明成熟的分化特化细胞可以恢复为原始多能干细胞(Takahashi K, 2006)。这一发现改变了我们对干细胞生物学的理解，使干细胞工具、技术和应用取得了令人兴奋和实质性的进展。这篇文章的重点是多能干细胞，因为他们提供了最有前途的未来应用。

在实验室研究干细胞-过去和现在

要利用干细胞的力量，它们必须首先在体外组织培养中保持。干细胞的培养扩展是棘手的，因为它们必须保持在未分化的状态，并且在需要之前不允许分化为其他细胞类型。简而言之，如果干细胞不是在对数期生长中分裂，它们就是在分化。从历史上看，多能干细胞在实验室中是出了名的难以处理，这主要是因为来自动物组织的试剂具有固有的可变性。

GMP:未来是关于过程弹性的

影响干细胞技术当前和未来创新的一个重要概念是良好生产规范(“GMP”)。这是由控制药品生产过程的药品监管机构(例如FDA)执行的正式法规所控制的。使用干细胞作为治疗剂需要专门的药物法规，称为先进治疗药品(ATMPs)。不像化学合成的药物，最终产品可以通过化学分析来确定，atmp是复杂的生物生物实体，整个生产过程决定最终产品。简单地说，在整个干细胞生命周期的制造过程中，每一种接触干细胞的试剂都成为最终产品的组成部分。因此，在“现实世界”中，在干细胞制造过程中使用的试剂的质量和一致性对于下游临床应用是至关重要的，即使该项目仍处于研发或临床前阶段。一旦保留临床应用，GMP已成为影响干细胞研究和应用的各个方面的主导概念。研究人员和临床开发人员都从以gmp为中心的干细胞技术创新中受益，这些创新提供了一致的生长特性和高质量的结果。

干细胞工作流程

在体外干细胞培养的各个方面都取得了克服过去挑战的重大进展。其中包括组织培养基、细胞外基质、3D合成细胞培养塑料、生长因子、解离酶、低温保存剂和分化技术的进展。干细胞体外培养的流程不是一个线性的过程，而是一个连续的循环，可以分为6个步骤:1)组织培养塑料制品的细胞外基质涂层;2)组织培养烧瓶的再生/播种;3)培养箱中细胞培养的扩大;4)培养基改变;5)一个瓶传代或“传代”;干细胞培养物的低温保存。干细胞工作流程如图1所示。

干细胞工作流程组成部分

细胞外基质

如今培养干细胞的技术比过去容易得多。干细胞以贴壁培养物的形式生长在组织培养瓶或培养皿的表面(如图1，步骤3所示)。为了使干细胞能够贴壁，必须用细胞外基质包裹。在早期，在培养中保持干细胞是一种努力，因为培养物需要生长在成纤维细胞的“喂养层”上。第二次细胞培养与干细胞培养相结合的要求是费力的建立和严重限制了实验和应用(由于污染的成纤维细胞与干细胞混合)。从小鼠肿瘤中分离出的细胞外基质消除了对饲养层培养的需要，但其一致性可能变化不定，并含有污染物。今天，研究人员从重组表达的细胞外基质中获益，其中含有laminin-511片段，它提供了广泛的细胞类型的高效粘附，而且易于使用(只需1小时的涂膜时间，节省了时间和成本)。非凡的多能性干细胞粘附是通过laminin-511片段实现的。重组细胞外基质laminin-511在哺乳动物细胞培养(如CHO细胞)或昆虫培养(如蚕蛹)中表达，从而消除了细胞外基质中对动物衍生产品的需求。另外，合成3D塑料支架(如Alvetex)也可以提供刚性定义的非生物基质。

培养基

早期干细胞培养基需要每天补充培养基。这意味着每周7天都要在实验室里进行干细胞培养。优化组织培养基组成，使培养在周末保持不改变培养基，实现无饲料，周末无干细胞培养。这听起来微不足道，但确实对从事干细胞研究的研究人员的生活方式产生了巨大的影响。与早期组织培养基不同的是，培养基的成分是完全确定的，不包含动物来源的产品。去除动物源性产品的重要优势在于去除动物源性产品固有的可变性，并保证细胞的持续生长。此外，无动物成分的配方消除了动物产品引起的感染风险(例如TSE风险)。生长因子是培养基中维持干细胞未分化状态的关键成分。市场上出售的产品含有从大麦中表达和分离的生长因子。

亚文化

干细胞在培养容器中进行细胞分裂。随着它们的生长，它们最终会超过自己的家园，必须传代培养到单独的烧瓶中，为进一步生长提供空间。通常的做法是使用消化酶将干细胞从培养物表面分离出来。从牛中分离胰蛋白酶在组织培养实验室中是常见的。目前产品的进展是使用在玉米中表达的胰蛋白酶，在室温溶液中是稳定的。胶原酶是一种可选的解离试剂，对广泛的细胞温和而有效，可用于无动物级和GMP级-再次实现稳健一致的培养条件，并消除对固有可变的动物源性产品的依赖。

低温贮藏

从培养物中获得的干细胞可以被冷冻和安全地储存(或“冷冻保存”)几十年。当需要时，冷冻保存的干细胞可以在培养中解冻、复活和扩展，提供可再生的干细胞来源。在干细胞的低温保存过程中，防止细胞死亡和基因型/表型的变化是至关重要的。今天的低温保存培养基可以在解冻后保持一贯的高细胞活力;保持细胞多能性，正常核型和增殖，即使在长期保存细胞。传统上，冷冻保存过程涉及一个速率控制的冰箱或一个专门的容器，以-1ºC/min的温度冷冻细胞。冷冻保存剂的进步已经不再需要速率控制的冷冻。这个过程现在很简单——你只需要把干细胞悬浮液放入-80摄氏度的冰箱中。此外，低温保存剂是GMP级的，不含动物源性成分。

分化

干细胞的力量在于它们的自我更新能力和分化成特殊细胞类型的能力。分化过程将干细胞从应用流程中移除。干细胞定向分化为特定的细胞类型使应用的数量增加。典型的分化方案是在几周内逐步改变培养基、细胞因子、生长因子和细胞外基质，从而引导干细胞进入特定的谱系和命运。今天，创新技术使用基因重编程因子快速(< 1周)将干细胞分化为成熟细胞表型。这一进展大大缩短了实验时间，并提高了分化细胞类型的制造能力。

表1。干细胞技术的进展。
创新产品的例子
胞外基质重组层粘连蛋白在CHO和家蚕iMatrix-511中表达
周末不需要更换培养基，GMP级，动物无StemFit培养基
重组生长因子，GMP级，动物游离StemFit蛋白
解离试剂在玉米中重组表达的胰蛋白酶。溶组织梭状芽孢杆菌中表达的胶原酶和中性蛋白酶
胶原酶NB
中性蛋白酶NB
不需要速率控制的冷冻。GMP级，不含动物，可用于临床。适用于所有细胞类型。STEM-CELLBANKER
通过基因重编程快速定向分化快骨骼肌
Quick-Endothelium
Quick-Neuron

未来科技与应用

疾病模型

成熟细胞类型的可再生资源有无限的应用。利用分化干细胞进行创新的一个令人兴奋的领域是疾病建模。在过去，研究器官或组织的疾病状态仅限于使用体内动物模型;然而，分化的干细胞打开了在体外特定细胞类型中创造疾病状态的机会。此外，目前的技术使类器官或“迷你器官”能够在实验室中生成。疾病特异性诱导多能干细胞还可以用于体外建立疾病模型，这是疾病研究和药物开发的宝贵工具，而不需要体内动物模型。理论上，任何组织都可以在体外创造出来。在干细胞疾病建模的一个令人兴奋的例子中，日本京都CiRA的Takayama博士成功地在类器官细胞和未分化的多能干细胞中建模了SARS-CoV-2的生命周期(Takayama, 2020年)(Sano, 2021年)(图2)。在另一个例子中，使用骨骼肌分化试剂盒从干细胞中生产骨骼肌肌管，以创建体外疾病模型(图3)。骨骼肌多能性干细胞模型也已成功用于开发杜氏肌营养不良症的新疗法(Moretti, 2020)。

用盘子养肉

在实验室里制造肉类，也就是通常所说的“人造肉”，正在取得有希望的进展。对环境的关注推动了对更可持续的肉类生产的需求，而不是传统的农业方法。干细胞研究本身在多个方面减少了对动物的使用，正如这里强调的那样。人工肉的生产在原理上很简单，但在实践中面临许多挑战，例如维持正确的环境和刺激，使培养细胞生产出具有动物源性产品的正确一致性和特性的肉。干细胞培养物在生物反应器中大规模扩增，分化为骨骼肌细胞。这些干细胞可以是结构化的，例如使用可食用的支架，或者使用非结构化的材料作为生产肉制品的原料(图4)。实现这一目标的工具和技术唾手可得:干细胞的膨胀和分化是非常高效的。然而，一个关键的考虑因素是商品的成本。目前的技术成本太高，但这是一个开创性的时代，研究正以令人兴奋的速度发展。

结论

干细胞技术在促进生物学、医学和食品生产方面的前景和潜力只有在干细胞培养条件一致且研究科学家和商业操作均可获得的情况下才能实现。雷电竞网址干细胞工作流程的多个方面都取得了令人兴奋的进展，简化了生产过程，提供了完全定义和无动物的产品。此外，符合GMP的试剂的可用性加快了干细胞疗法的临床转化和药物发现。干细胞技术的发现和应用的光明未来奠定了基础。

作者

William Hadlington-Booth博士是AMSBIO干细胞技术和细胞外基质事业部经理。Erik Miljan博士是开发细胞疗法治疗一系列退行性疾病的先驱。他拥有香港大学生物化学博士学位。如需进一步信息，请联系:
William@amsbio.com

参考文献

莫雷蒂，A. F.等人(2020)。体细胞基因编辑改善猪和人杜氏肌营养不良模型的骨骼和心肌衰竭。自然医学杂志，26,207-214。
高桥K等人(2006)。用特定因子诱导小鼠胚胎和成体成纤维细胞的多能干细胞。电话126,663 -676。
高山，K.(2020)。SARS-CoV-2研究的体外和动物模型。药理学趋势，41。513 - 517。
Sano, E.等人(2021年)。模拟SARS-CoV-2感染及其与表达ace2的人iPS细胞的个体差异。科学通报，24(5)，102428。