3D和彩色的细胞内世界:英国国家同步加速器钻石光源生物冷冻成像波束线B24的发展
2020年9月14日
作者:Maria Harkiolaki和Chidinma Okolo代表钻石光源有限公司
光束线首席科学家Maria Harkiolaki和支持科学家Chidinma Okolo解释了两种强大的显微镜方法如何结合在一起,在接近生理条件下提供细胞结构和成分的互补高分辨率冷冻成像。
英国同步加速器钻石光源(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html)的生物冷冻成像光束线B24开发了一种高分辨率3D冷冻成像平台,可以在接近生理条件下对细胞和细胞群进行详细的3D x射线和可见光荧光成像。该平台已在最近的出版物[1]中提出,在该平台中,它被用于研究哺乳动物细胞中的呼肠孤病毒囊泡排出,并允许在感染后早期的几个小时内通过细胞质在3D中跟踪内体囊泡内的病毒衣壳。
背景
生物学研究的成功取决于深入了解一个生命系统,从它的基本化学成分到组成细胞的结构,以及组织和生物内部的相互作用。显微镜是这个过程的基础,它使我们能够直接记录生命的复杂结构,但正如所有的研究工具一样,它受到其主题的限制。查看宏观意味着观察者获得了系统的顶层视图,但错过了细节,而当我们查看微观时,通常会牺牲上下文。例如,具有宽视场的CAT扫描将记录生物体内的整个组织排列,但它需要具有仅几微米视场的电子显微镜才能看到同一生物体中单个细胞内的精细结构。为了不断提高成像分辨率和细节捕捉,我们所采取的每一步都需要做出牺牲。细胞需要从自然环境中提取出来,需要对它们进行修饰以突出它们,并且需要改变它们的化学成分来固定它们——图像只有在样本的运动和振动允许的情况下才能清晰,因此,当我们寻求获取细胞结构和精细化学定位的信息时,使用不同分辨率的显微镜技术,同时尽可能多地保留生理特征和相对大小,这变得至关重要。此外,当提高图像分辨率的尺度时,理想情况下,我们会跨越在能力边界上重叠的方法(分辨率随着视场的缩小而逐渐增加),允许从一个尺度到下一个尺度的数据有效重叠,高分辨率成像受益于较弱技术提供的更广泛的背景。
英国同步加速器钻石光源的相关低温成像光束线B24致力于解决上述所有问题,并在接近生理状态的样品上提供跨尺度和对比方案的直接相关3D成像数据。B24的成像平台包括一个新型的超分辨率荧光结构照明显微镜(cryoSIM)和软x射线断层扫描终端站(cryoSXT),允许用户可视化生物样本,如细胞和组织切片。
钻石光源光束线B24主舱(顶板);cryoSIM(低温结构照明显微镜)(左下)和cryo-SXT(低温软x射线断层扫描)显微镜(右下)。
它在低温下提供3D细胞相关成像,并具有以下特点:(a) 3D数据捕获,(b)相同的样品荧光和x射线成像,(c)最小的样品处理要求,(d)图像分辨率为25nm, (e)快速数据收集和(f)通过同行评审过程易于遵循访问程序(对学者而言)。此外,束线还提供辅助设备的访问和支持,以允许样品制备和评估以及数据处理、分析和相关性。
跨尺度生物成像和B24范围
B24设施使用的适宜性和要求。
生物成像的当前要求
随着我们进一步探索生物系统,对细胞水平的生物/生物医学成像的要求不断增加,变得更加复杂。理想情况下,信息应该在3D中捕获,以尽可能高的分辨率,并让我们清楚地了解细胞和组织的结构和组成,而不会因为苛刻的样品制备程序或显微镜要求而导致人工合成而失去信息的保真度。在波束线B24,这是通过冷冻保存来实现的,细胞粘附或沉积在网格样品支架上(涂有穿孔碳支撑膜的3mm金晶片),在液氮中冷冻,然后在整个转移和暴露于光下保持低温。这确保了样品不仅在成像过程中保持完美的静态,而且在暴露于高分辨率成像所需的恶劣照明条件下很少或没有损伤。此外,由于不需要化学固定或包埋,样品内没有引起化学改变,因此误解的风险最小化。
携带人类HFF细胞的3mm样本网格(细胞轮廓可在方框中看到)。左边的面板显示了用于转移网格的镊子和薄膜覆盖表面上的两个金色网格的大小。
一般来说,成功的生物成像的其他必要先决条件是可重复性、可获得性和易用性。新技术应始终可靠地交付,尽快可用,并具有明确的访问路径。在beamline B24,相关的冷冻成像平台在过去的一年里已经完成了测试,从癌症生物学、感染和病原体清除到细菌、藻类和古菌生物学等多个领域的研究小组都从这项技术中受益,而beamline团队则专注于简化用户支持、可访问性、样本制备和测绘以及数据收集和处理。B24的数据收集每个项目通常需要3-5天(在cryoSIM和cryoSXT上都需要时间),并产生许多gb的3D数据(10-30个SIM数据集,每个SIM数据集1-3个x射线层析图),这些数据在细胞内和细胞间的面积为100微米。
来自人类U2OS细胞的3D cryoSXT数据切片,显示了可以通过软x射线断层扫描看到的细节水平,以及在接近生理条件下低温保存的哺乳动物细胞中的细胞器和突出特征。
三维cryoSXT数据切片(左)显示呼肠孤病毒感染的细胞区域(细胞核和细胞质分别用蓝色和绿色箭头表示;该单元格与其相邻单元格的界面用橙色箭头标出)。叠加CryoSIM数据(也是3D数据)(右)描绘感染后两小时核周区域携带病毒载量的细胞器。该图清楚地显示了结合高分辨率成像技术的好处,如SXT(细胞超微结构的纳米分辨率;用3D超分辨率荧光SIM(感兴趣的粒子的定位,在这种情况下,呼肠孤病毒,在3D)。在SXT中,细胞核附近发现的多泡体子集现在可以用SIM识别为病毒载量的载体。
光束线团队
B24目前有一个由五名科学家组成的核心团队,他们都致力于所提供的方法的开发和雷电竞网址自动化。他们是两名生物学家,一名化学家和两名物理学家,他们的专业知识从分子和细胞生物学到低温样品处理,光束线仪器和软件开发。
目前的B24核心团队。在cryoSXT显微镜旁边的是M Harkiolaki博士(左外),
C Okolo博士(左中),T Fish先生(右中),I Kounatidis博士(右外)。新成员
M Koronfel博士最近加入了B24。
B24组采集并评估x线。
他们得到了光束线技术人员、工程师和设计师的支持,以及钻石光源内部从建筑和设施维护到IT和软件支持和开发的许多其他支持团队的支持。公司所有部门在很大程度上是相互关联的,并在全年内为光束线提供快速和相关的支持。一个热情而专业的用户办公室团队在技术和创新团队与用户社区之间提供了一个方便的接口,用户社区参与光束线并使用可用的设备。
新技术的开发超出了单个组织的职权范围,并极大地受益于跨机构合作。在B24,与英国牛津大学生物化学系的美光公司进行了富有成效的合作,开发并交付了cryoSIM。这项工作得到了来自世界各地的显微镜和科学软件专家的支持,并继续作为一个合作项目发展。
B24的软件开发由核心团队与钻石光源的科学软件、运动和控制组密切联系的努力推动,但超出了国内研究所的范围,涉及与全球软件科学家的合作。与法国南特大学的P. Paul-Gilloteaux博士(3D相关软件eC-CLEM的开发者)的合作涉及定制的3D图像配准软件的定制开发,专门针对SIM和SXT,目前正在进行中。
国际首创
然而,除了显微镜和科学软件专家之外,主要是研究人员自己推动和指导成像技术的发展。Beamline B24有幸与热情而坚定的研究科学家合作,他们致力于研究方法,反馈设计过程并推动自动化开发。雷电竞网址因此,B24的相关成像平台现在可以提供国际上第一个用户友好的,高分辨率的3D相关冷冻成像。正如剑桥大学病毒学学部亨利·戴尔爵士研究员兼大学讲师斯蒂芬·格雷厄姆博士所评论的那样,“B24的设施为我们提供了探测细胞内病毒感染的独特工具。通过将超分辨率光学冷冻显微镜与软x射线冷冻断层扫描相关联,我们可以准确地了解每个细胞处于感染的哪个阶段,并可以探测病毒在它们利用的宿主细胞中诱导的结构重排列。无固定和无污渍的工作流程,加上使用cryoSXT可获得的巨大景深,对我们尤其有利,因为它允许我们捕捉细胞内的罕见事件,比如在病毒穿过核膜时捕捉病毒。”
S Graham博士和他的合作者C Crump博士在束线B24处收集HSV1感染细胞的数据
Gianlucca Tozzi博士是英国朴茨茅斯大学蔡司全球中心的生物工程读者和主任,他在组织工程生物组织和生物材料的研究中使用了B24成像平台。他说:“在B24工作是一次很棒的经历。在所有技术方面的支持都非常出色,并且有真正的意愿推动技术在解决复杂成像模式方面的进一步发展,这越来越需要解开生物学机制。我期待着继续这种出色的合作。”
这种新颖的成像方法与癌症生物学领域特别相关。正如英国华威大学化学系的Peter Saddler教授所强调的:“B24为我们在阐明新型抗癌药物的作用机制方面的工作增加了新的维度,这些药物可以对抗治疗的耐药性,特别是在癌细胞中被可见光特异性激活的前药物。相关的超分辨率荧光显微镜和3D软x射线断层扫描使我们能够监测荧光药物的定位和药物诱导的细胞器亚细胞变化,如线粒体和内小体,在低温保存的癌细胞中接近其原生状态。”
值得注意的是,工业也是推动发展的动力。正如钻石公司工业联络副主管Claire Pizzey博士所说:“工业参与是钻石公司任何光束线工作的一个重要方面,因为多达10%的操作时间可以用于保密的研究和开发。
G Tozzi博士的团队在B24收集绵羊分化干细胞的形态学数据。
B24对相关显微镜的商业兴趣正在迅速增长,最近的客户项目集中在制药行业的关键领域,如新型疗法和疫苗开发。对工业客户特别有价值的是波束线的全面服务方法,不需要事先了解。B24的专家团队可以为项目的所有阶段提供支持,从实验设计和数据收集到分析和报告。我们的客户非常重视及时获得的科学见解,这些见解将用于他们自己的研发管道。”
传达信息
通常,而且出乎意料的是,一旦显微镜装置投入使用,主要的障碍是让那些将从它中受益最多的人知道它现在是可用的,以及他们如何以最省时和最富有成效的方式利用它。在B24,我们的网站(www.diamond.ac.uk/Users.html和https://www.diamond)上有完整的流程文档。ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html),并伴随着协议和专业知识,允许所需步骤的标准化,并从样品制备和处理以及数据收集和分析中消除猜测元素。
在B24,通过结合冷冻sim和冷冻sxt显微镜的功能,开发了一种新的成像平台,填补了以前未满足的生物成像需求,为生物材料的内部工作提供了有价值的见解。一种方法允许我们绘制化学特征的位置,另一种方法为我们提供超微结构信息和细胞内容,实际上是对细胞进行CT扫描,并突出显示感兴趣的区域。一旦组合在一起,研究人员就有了一个细胞的3D地图,以及感兴趣的分子在其中的具体位置。这种创新的和用户友好的显微镜设置在波束线B24完美地展示了什么可以通过多学科合作实现,现在可用于更广泛的研究社区。
更多信息请访问maria.harkiolaki@diamond.ac.uk
参考文献
1.三维相关冷冻结构照明荧光和软x射线显微镜阐明呼肠孤病毒胞内释放途径。Cell 182, 1-16(2020)。