无缝高效液相色谱法转移

2021年7月16日

作者:Brigitte Bollig博士代表岛津欧罗巴有限公司

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HPLC在各种应用中用于目标化合物及其相关杂质的分析，方法是在自己原有的分析条件和/或指定的测试规则下创建的。如果这些验证过的方法与几种不同的HPLC仪器一起使用，系统之间的可重复性(可比性)和测量的可重复性是一个重要因素。

特别是梯度洗脱、保留时间、分辨率等因素会因方法转移而受到很大影响。例如，虽然现有的方法可以成功地将目标化合物从一个系统中共存的杂质中分离出来，但相同的方法可能无法成功地将这些化合物从其他单位中分离出来。
因此，通常需要优化每种仪器的分析条件，这是一个极其耗时的过程。这样的保留时间和分离的变化是由不同的系统容量和泵性能造成的。特别是在超高速分析中，由于专用色谱柱的体积很小，即使系统体积的微小差异也会对分析结果造成很大的影响。

系统体积和梯度延迟

当将一种方法从一个LC单元转移到另一个LC单元时，必须考虑系统体积差异。图1为流动相储层至LC仪柱的流线。梯度延迟体积是指两种或两种以上洗脱液混合点与色谱柱入口之间的系统体积。如图1所示，低压和高压梯度系统的梯度延迟体积不同。即使是同一类型，不同长度和/或内径的管道可以提供不同的梯度延迟体积。
图2显示了梯度延迟如何影响分离。一般来说，即使梯度已经在时间程序上开始，其实际开始时间(增加有机溶剂浓度的时间)也会延迟。图3显示了系统体积较大的单元(下色谱图)的梯度开始时间比系统体积较小的仪器(上色谱图)晚。这可能导致不同hplc上的不同分离模式。因此，在转移方法时必须考虑系统体积差异，并且必须通过调整初始保持时间(梯度启动时间)来修改梯度程序。然而，这些程序不能仅仅适用于测试规则严格规定的分析条件。

修正系统延迟量的方法传输示例

在讨论了方法迁移引起的色谱图差异及其来源之后，下一部分将介绍一个使用多个不同系统体积的lc进行分析和方法迁移的例子。使用岛津LC-2050集成LC单元将延迟体积与各种仪器进行匹配，然后通过使用不同LC进行相同的分析来比较色谱图。
第一部分将色谱图与之前岛津LC-2030 Plus模型进行比较。结果如图3所示。这一比较证实，在相同的分析条件下，LC-2030 Plus的系统体积与LC-2050相当，可产生相同的色谱图。
下一个色谱图与另一个供应商的LC系统和第一代岛津LC- 2010c HT集成LC进行了比较。结果如图4所示。在本例中，其他供应商的lc(系统A)和LC-2050的系统容量是等效的，因此在相同的分析条件下，它们产生了等效的结果。
然而，与LC-2050相比，LC-2010C HT具有更大的系统体积，因此LC-2050添加了延迟体积兼容套件以匹配系统体积。这导致几乎相同的色谱模式，就像在前面的情况。因此，在传输方法时，重要的是要匹配系统体积，以便梯度同时开始。

分析条件传递和优化功能

分析条件转移和优化(ACTO)是一种有效的方法转移工具，也是岛津LabSolutions软件最新版本的一部分。ACTO的一个函数叫做“梯度开始时间调整函数”。
将一种分析方法从现有的LC仪器转移到另一个单元，由于系统体积和溶剂输送单元规格的差异，可能会导致保留时间的差异。这个问题可以使用ACTO的梯度开始时间调整函数来解决，如图5所示。
梯度调整功能在方法创建过程中配置。如果用户只是输入系统容量的差异，那么在分析过程中会自动添加或减去校正后的初始保持时间。这样可以在方法转移前后获得相同的色谱图。
该功能还可以纠正兼容性套件无法考虑的细微错误(例如泵特性和溶剂输送机制)，并可实现最佳兼容性。此调整与时间程序分开配置。因此，没有必要重新配置现有的时间程序。因此，岛津的i系列仪器和ACTO功能可以在各种应用中提供更高的效率和可靠性。

方法转换使用ACTO函数

在本例中，使用LabSolutions工作站软件功能来匹配方法传输的系统延迟量，而不是通过更改混合器或油管。在图6中，使用岛津LC- 2060c 3D MT和不同供应商的LC仪器(系统B)对防晒霜混合物样品进行分析。
在LC-2060C 3D MT中可用的两条流线(HPLC和UHPLC流线)中，使用HPLC流线。虽然在两台仪器上应用了相同的方法，但由于两台仪器的系统体积不同，10分钟后的峰值并不匹配。利用软件中ACTO的梯度开始时间调整功能，调整梯度开始时间以克服系统体积差异并进行分析。
在此之后，如图6末尾的表格所示，所有高峰的留存时间几乎相同。使用这种方法，可以通过设置梯度开始时间来实现两个不同系统的兼容性，从而实现更平滑的方法迁移。请注意，各药典允许调整初始保持时间，不认为是改变方法，因此通常不需要重新验证。