混合模式强阳离子交换固相萃取微孔板的高效液相色谱-质谱分析

样品制备在任何类型的色谱分析中都是重要的。虽然它可以增加额外的时间，但在注入到系统之前清理样品的过程会给分析人员带来一系列的好处-更好的回收率，更可重复的分析，更少的仪器停机时间，减少故障排除，以及由于注入的不需要的化合物的减少而不那么复杂的色谱图。所有这些都可以节省仪器重复工作或维护所需的时间。

传统的固相萃取产品是由一个松散填充的树脂夹在两个熔块之间组成。虽然这是已知的工作，但它可能会带来一些问题，使分析复杂化或导致产生糟糕的数据。这些问题是由于产品是如何包装到一个井或墨盒-空隙可以发生在顶部熔块下;通道可以通过树脂床形成，这可能导致树脂和分析物之间的相互作用效率较低，或者每个产品中的压缩量或树脂重量可能会发生变化。
图1。与松散填充SPE方法相关的常见问题。
Microlute®CP SPE产品由一种独特的混合设计组成，即均匀分布的孔隙与保留介质相结合的固体互连网络。这种设计的优点是通过产品的流动是一致的，并增加了结构中存在的分析物和保留介质之间的相互作用。这两个特点结合在一起的结果，产品提供了高回收率和可重复性的结果。本技术说明使用30mg Microlute®CP强阳离子交换(SCX) 96孔板与五种竞争对手的30mg松散填充SCX产品进行回收性能和再现性比较。
图2。混合聚合物结构的示意图，显示了熔块的多孔结构，活性树脂固定在整个孔隙结构中。

简介

Microlute®CP SCX产品是一种混合模式聚合物SPE产品-离子交换和反相的组合。这将产生具有两种保留机制的产品，可以对这两种机制进行微调，以使SPE方法具有更大的灵活性。反相功能允许在疏水相互作用上分离分析物，允许保留被有机修饰剂浓度改变。而离子交换允许树脂和带电分析物之间的选择性强离子相互作用。与使用硅基树脂[1]相比，将聚合物树脂引入固相萃取具有一些额外的优点。这些包括:
•聚合结构不包含任何在二氧化硅中发现的高活性位点。其中包括硅醇基团，它可能与分析物产生不必要的二次相互作用，在某些情况下可能导致不可复制的恢复。
•二氧化硅的结构在pH值2 - 7.5范围外也很容易受到影响。如果pH值超出此范围，则表面的二氧化硅或键合官能团可能发生水解[2]。这将导致非常糟糕和不可复制的复苏。另一方面，聚合物树脂耐pH，允许它们在整个pH范围内工作(pH 0 - 14)。
•结合在二氧化硅表面的官能团需要用有机溶剂进行调节，以激活保留机制，然后用水溶液平衡。而聚合树脂则不一定需要经过这一调理步骤。
在固相萃取过程中，聚合物树脂对干燥不太敏感，硅树脂可能会变干，失去其保留功能[3]。

强离子交换不适用于强酸性或碱性分析物(在整个pH值范围内有电荷的分析物)，因为带电分析物与带电离子交换树脂的不可逆结合。弱分析物与强离子交换作用良好。这是因为对于弱酸性或碱性分析物，可以打开或关闭分析物的电荷，从而允许通过改变pH值进行选择性结合。为了优化这种结合，应用了2 pH值规则:
•当溶解分析物的溶液的pH值等于分析物的pKa值时，分析物是50%的电离，pH值可以用来调整化合物的电离程度:
-酸性:100%电离:pH值高于pKa或100%非电离:pH值低于pKa
-基本:100%电离:pH值低于pKa或100%非电离:pH值高于pKa
图3。一个图表显示了弱酸化合物和弱碱性化合物的2 pH规则，pKa分别为4和8。

对于典型的强离子交换方法，分析物被预处理到pH值，在那里它们被充电，然后加载到树脂上。这使得它们能够通过离子相互作用与树脂牢固结合。在该方法的洗涤步骤中保持相同的pH值，使分析物在洗去干扰化合物的同时保持与树脂的结合。为了允许洗脱，改变pH值以中和电荷，使分析物停止与树脂结合并从产品中洗脱。

实验

表1。高效液相色谱条件。
LC系统安捷伦LC- ms，(带有1260 LC
和单四极质谱仪)
柱猛禽联苯30 × 2.1 mm, 1.8µm
列温度:45°C
注射体积2.00 μ L
流量600 μ L/min
流动相A 0.1%甲酸在水中
流动相B 0.1%甲酸甲醇

溶剂组成时间(min) A% B%
0.10 95.0 5.0
4.30 57.5 42.5
6.50 57.5 42.5
6.51 20.0 80.0
8.20 20.0 80.0
8.21 95.0 5.0
14.00 95.0 5.0

表2。质谱仪条件。
参数值
气体温度350°C
气体流量13l /min
喷雾器30磅
毛细管电压4000 V
停留时间100v
Fragmentor Voltage SIM
扫描类型ESI
离子模式ESI

化学物质

咖啡因，沙丁胺醇，普鲁卡因酰胺，阿替洛尔，品多洛尔，心得安，去西帕明，丙替林，丙咪嗪，阿米替林，去甲替林，甲酸，甲醇，水，35%氨溶液。

样品制备

在甲醇中制备1000µg/ml的所有基本分析物。用含0.1% (v/v)甲酸的水将500 μ L原液稀释至50 mL，制成基本负载溶液。

固相萃取法

对于Microlute®CP SCX产品和竞争产品，总共测试了12口井。每个测试井都用1000 μ L甲醇进行条件处理，然后用1000 μ L水进行平衡。将1000 μ L基本负载溶液完全加载到平板上。加载后，1000 μ L含有0.1% (v/v)甲酸水溶液的水用于洗涤吸附剂。然后用0.1% (v/v)甲酸溶液在甲醇中强力有机洗涤。
为了洗脱感兴趣的分析物，使用500 μ L含5% (v/v)氨的甲醇。然后使用Porvair Sciences Ultravap®Levante(# 500226)在35°C的N2下蒸发洗脱液至干燥。使用另500 μ L含5% (v/v)氨的甲醇进行重复洗脱，并使用相同的方法蒸发至干燥。
为了重建每个样品，在每个收集瓶中，加入10µL 1000µg/ml咖啡因(ISTD)，然后加入790µL 60% (v/v)甲醇/含有0.1% (v/v)甲酸的水，以创建12.5µg/ml的溶液。用40µL 12.5µg/mL溶液与760 uL 60% (v/v)甲醇/含有0.1% (v/v)甲酸的水进一步稀释，生成0.625µg/mL溶液，用于注射。

结果与讨论

图4。基本分析物色谱图校准标准。峰值分配可以在表3中找到。
表3。分析的基本化合物的性质和质谱参数-来自Pubchem[4]的预测值。
不。复合型R.T
(min)分子式分子量LogPa pKaa

1沙丁胺醇Basic 0.70 C13H21NO3 239.31 0.3 10.3
2 Procainamide Basic 1.04 C13H21N3O 235.33 0.9 9.3
3阿替洛尔碱性1.23 C14H22N2O3 266.34 0.2 10.4
4 Pindolol Basic 3.09 C14H20N2O2 248.32 1.8 9.3
5咖啡因ISTD 3.71 C8H10N4O2 194.19 -0.1 14.0
6心得安5.56 C16H21NO2 259.34 3.0 9.4
7去西帕明Basic 6.87 C18H22N2 266.40 4.9 9.6
8 Protriptyline Basic 6.98 C19H21N 263.40 4.4 9.7
9丙咪嗪Basic 7.09 C19H24N2 280.40 4.8 9.4
10去甲替林Basic 7.32 C19H21N 263.40 3.9 10.5
11阿米替林基本7.57 C20H23N 277.40 5.0 9.4

复苏的比较

图5。分析物回收率与其他商业SPE产品的比较。
再现性比较
图6。分析物%RSD与其他商业SPE产品的比较。

对于再现性，较低的%RSD意味着回收率的再现性更高。分析物的%RSD值如图6所示。Microlute®CP SCX成功地将每种化合物的%RSD值保持在2.6%以下。它在每种化合物上的再现性优于所有竞争对手，只有阿米替林与之非常接近。无论是最极端的亲水化合物还是最疏水化合物，都不存在不可重复的结果。这再次表明Microlute®CP SCX产品在广泛的基础分析物中表现出色。

总结

Microlute®CP SCX 30 mg 96孔板可以有效地保留广泛的亲水和疏水基本化合物。它在不同种类的分析物范围内提供了有利的回收。在本研究中分析的每种化合物与竞争对手板进行比较时，可以看到较低的%RSD值- Microlute®CP SCX的平均RSD为1.6%，而最佳竞争对手的RSD为2.4%，最差竞争对手的RSD为5.9%。这确保了产品提供可靠和可重复的结果，这是测试中需要对数据输出的置信度的重要指标。

参考文献

1.C. F.普尔，固相萃取，Elsevier, 2020, p.第3章:多孔聚合物吸附剂。
2 P. V. Brady和J. V. Walther，“25°C中性和碱性溶液中硅酸盐溶解速率的控制”，地球化学与宇宙化学学报，第53卷，no. 1。11, pp. 2823- 2830,1989。
3.M. N. Qureshi, G. Stecher, C. Huck和G. K. Bonn，“多酚类化合物固相萃取聚合物基吸附剂的制备”，中欧化学杂志，第9卷，no. 1。2，页206-212,2011。
4“PubChem”，国家医学图书馆，[在线]。可用:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/。[访问25 04 2021]。