液相色谱-高分辨精确质谱分离卡马西平异构体代谢物

关于废水中存在排泄药物的环境问题有充分的文件证明，飞行时间和Orbitrap仪器等高分辨率质谱(HRMS)的引入有助于对其进行检测。尽管HRMS是一种高度特定的技术，但干扰可能会发生，特别是在复杂矩阵中。本文描述了在使用Thermo Scientific Orbitrap Q Exactive HRMS仪器[2]分析废水样品卡马西平(CBZ)及其代谢物时，如何克服遇到的一些问题

CBZ是一种广泛用于治疗癫痫和神经痛的处方药，众所周知，它是一种持久性环境污染物，在废水处理过程中不会被分解。
大多数药物在排泄之前就被代谢掉了，然而在废水中检测这些代谢物才刚刚开始进行常规测试。CBZ主要以反式10,11-二氢-10,11-二羟基卡马西平(trans-CBZdiOH)代谢物的形式排泄，但也会形成环氧化物代谢物，即环氧卡马西平(CBZEP)，它对人体[3]有负面副作用，在环境中是有毒的。还有5种CBZ的单羟基代谢物与CBZEP具有相同的前体离子精确质量，由于它们结构相似，在破碎时产生的产物离子丰度最高。奥卡西平(OxCBZ)是CBZ的替代品，因为它不会代谢成有毒的CBZEP，但它也具有与CBZEP和单羟基代谢物相同的分子式。这使得即使使用HRMS也很难区分不同的代谢物，需要仔细解释数据和良好的色谱，以确保单羟基代谢物从CBZEP中分离出来，并且没有报告虚假的高浓度。另一种替代CBZ的新药是eslicarbazepine (EsliCBZ)，也纳入了本研究。
本研究纳入分析物的化学结构、前体离子及分子式汇总如表1所示。
表1。本研究的化学结构和前体离子。
用于分析的质谱仪是一台Thermo Scientific Q-Exactive Orbitrap质谱仪，配有Dionex Ultimate 3000 RS泵、Dionex Ultimate 3000 RS自动进样器(温度控制在10℃)和Dionex Ultimate 3000 RS柱室(温度控制在30℃)。
软件为Chromeleon®、Xcalibur™和Tracefinder™。
电离过程采用电喷雾正电离模式，喷雾电压为3.5千伏。护套和辅助气分别为45和10任意单位，毛细管温度和辅助温度均为300℃。全MS-SIM实验范围为50 ~ 750 m/z，靶离子在靶MS2方法中指定，隔离窗口为4 m/z。两个实验的质量分辨率都是35000。
色谱柱为Waters Atlantis®dC18色谱柱150 × 2.1 mm，粒径3 μ m。
在超纯水中流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸。LC梯度开始在2分钟内为99% B，然后在3分钟内为70% B，并保持在该水平11分钟。B的含量在1分钟内下降到1%，并维持3分钟。最终在1分钟内回到99% B，并在9分钟内重新平衡。流速0.2 mL/min，进样量10 μL。
首先分别注射浓度为1000 ng/mL的CBZ、顺式- cbzdioh、反式- cbzdioh、CBZEP、OxCBZ、EsliCBZ和CBZ-10羟二氢溶液，测定每种分析物的保留时间。然后将它们作为混合物注射进去。
在加工过程中，CBZ在237.11→194.0963的特定跃迁处观察到三个峰(图1A)。这是一种合成混合物，溶液中不应包含任何具有这种特殊过渡或前体离子的其他药物，特异性的丧失最初令人担忧。在7.9 min的干扰对应EsliCBZ，在12.5 min的干扰对应10,11-二氢-10-羟基卡马西平，跃迁分别为297.12→194.0963和255.11→194.0963。虽然它们具有相同的产物离子，但前驱体离子对它们来说是非常不同的。
CBZEP在9.5分钟被观察到类似的污染，这次干扰保留时间为6.4和7.2分钟，这与顺式和反式cbzdioh一致。

更仔细的观察表明，这可能是由于离子源中的碎片。虽然电喷雾是一种软电离技术，但一些分析物在离子源[4]中会被分解。
通过实验证实了额外的峰值是由于源内破碎造成的。EsliCBZ溶液以10µL/min的流速直接注入到离子源中。
将EsliCBZ溶液注入离子源(图2A)，产生了预期的EsliCBZ前驱体离子m/z 297.1227，钠加成物m/z 319.1045和与CBZ一致的源内击穿产物m/z 237.1017。在层析过程中，EsliCBZ从柱中洗脱，并在进入离子源时部分分解为CBZ。这意味着在EsliCBZ的保留时间有两个前体离子存在，在m/z 297.1227处的EsliCBZ和在m/z 237.1017处的分解离子。这两种离子都将通过质谱仪并在碰撞槽中产生各自的产物离子。
当反式cbzdioh注入到离子源中时，也观察到类似的破坏。
将trans-CBZdiOH溶液注入离子源(图2B)中，生成trans-CBZdiOH的预期前体离子m/z 271.1075和与CBZEP和cbz单羟基一致的击穿离子m/z 253.0969。注入实验是在正常离子源条件下进行的，离子源中没有注入碎裂能量。
这两个输注实验证明在离子源中可以发生一些转换。在发生转化的地方，被分析物被保留时间很好地分离。然而，单羟基代谢物尚未进行测试，这增加了分析CBZ及其代谢物的复杂性。因此，需要可靠的色谱和前体和产物离子数据的仔细解释，以确保正确的分析物被选择和准确测量。
由于缺乏单羟基标准，废水样品被用来确定所有代谢物的保留时间。该仪器出色的灵敏度和分辨率有助于将样品直接注入到液相色谱质谱系统中，在分析前只对样品进行过滤，这仅限于少数样品。这将确保在样品清理或浓缩步骤中，不会因回收率差而遗漏分析物。

采用所开发的LC法对废水样品进行分析，发现部分样品的过渡峰m/z为253.10→210.0921。253.10的3个主要产物离子分别为m/z 180.0814、182.0971和210.0921。从CBZEP标准中观察到另一个产物离子，其浓度为m/z 254.0812。图3B表明，m/z 253.10→210.0921的过渡没有那么特异性，尤其是对CBZEP，但可能是单羟基代谢物的首选离子。在反式cbzdioh(7.6分钟)之前洗脱的峰被认为是葡萄糖醛酸酯代谢物。经过仔细的选择，确定了环氧化合物的一个更具体的跃迁(m/z 253.10→182.0971)，从而进一步将其与干扰物区分开来。采用改进的色谱法和比色过渡为CBZEP的定量提供了良好的方法。未知' A '有一个前体离子m/z 255.1133，不是10,11-二氢-10-羟基卡马西平，因为两者的保留时间不同。tMS2实验的隔离窗口更改为2 m/z，从而消除了这种干扰。
从CBZEP标准物中可以看出，253.10→182.0971和253.10→254.0812是CBZEP特有的跃迁，使用这些产物离子CBZEP从其他分析物中分离出来(图3 C和E)。m/z为254.0812的产物离子比前体离子具有更高的分子量。精确质量符合C15H12NO3+分子式。这可以用环氧环开口形成二羟基和NH2的丢失来解释(图4B)。
图4。CBZEP产物离子(253.10→254.0809)的实验与理论谱图及CBZEP 13C同位素萃取离子色谱图的比较
= 254.1002。

需要确认产物离子(m/z 254.0812)不是CBZEP的13C同位素。CBZEP的13C理论同位素见插图(图4C)。比较实验离子和CBZEP的理论同位素模式，证实这是CBZEP (m/z 254.0810)的产物离子，而不是13C同位素(m/z 254.1005)。使用分辨率较低的仪器，不能使用CBZEP的产物离子(m/z 254.0821)，因为不可能将其与13C同位素(m/z 254.1015)区分开来。
HRMS是非常敏感和选择性的，但是，对于复杂的混合物，稳健的色谱法仍然是必不可少的，仍然需要谨慎地解释HRMS数据，以防止干扰和假阳性。

确认

本研究中使用的LCMS/MS系统由no药片项目资助，作为欧盟跨国领土合作项目INTERREG IVB NWE的一部分资助;这种支持得到了极大的肯定。这项工作也由Phos4You项目在NWE292赠款下通过INTERREG VB西北欧洲项目(2014-2020年)提供部分资金。我还要感谢我的博士导师Moyra McNaughtan博士和John MacLachlan博士。

参考文献

1.嗅探器,2010年。沉积物和污泥中所选药物和滥用药物的分析方法，可在以下网站获得:http://www.sniffer.org.uk/files/9113/4183/7992/ER09_Final_e-version_FINAL_3May101.pdf。
2.罗伯茨,有机,2017。LCMS/MS法测定和鉴别废水中药物和化学代谢物。博士论文，格拉斯哥加里多尼亚大学。
https://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.726806
3.苗族,X.-S。梅特卡夫，c.d.， 2003。液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水溶液样品中卡马西平及其代谢物。分析化学，32 (5)，pp. 369 - 369。可以在:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14572037。
4.巴赫曼，布莱克，W.，施耐德，R.J.和克劳斯，M.， 2014。废水中的卡马西平及其代谢物:在德国和葡萄牙的分析陷阱和发生。水资源研究，57,pp.101-114