用多模态色谱优化病毒载体纯化策略

到2027年，全球疫苗市场预计将超过850亿美元，年增长率为c. 9%。与此同时，全球基因治疗市场预计将超过50亿美元，年增长率甚至更快，约为34%。成功使用病毒制剂作为核酸传递载体或疫苗是这些迅速发展的生物医学部门的最重要贡献之一。随着基于病毒的产品的多样性和临床应用的持续增长，下游加工过程中的挑战也在不断增加。考虑到临床应用、生产可扩展性和固有的病毒特性，色谱可以用于简化下游流程，从而帮助满足当前的需求。

下游病毒纯化的挑战

病毒被应用于从基因治疗到疫苗开发和癌症治疗的众多临床应用中。当前病毒颗粒纯化的下游工艺大多采用了最初为纯化重组蛋白和生物制剂(如单克隆抗体)而开发的方案。与蛋白质分离类似，病毒纯化的下游过程也必须确保在整个生产过程中活性和稳定性等基本病毒方面保持完整[3]。然而，病毒颗粒复杂的生物物理性质构成了一些传统蛋白质纯化方案无法有效解决的严重挑战。与单个蛋白质不同，病毒颗粒要大得多，由多种蛋白质组成的复杂矩阵以独特的三维结构排列，称为衣壳。此外，它们容易受到流体剪切应力条件、非生理pH值、表面活性剂和界面应力的损伤(图1)。病毒样颗粒、逆转录病毒和慢病毒等包膜病毒颗粒特别容易受到损伤，并具有额外的表面特征(如脂质双分子层)和/或经历了翻译后表面修饰(如糖基化)，这可能进一步使下游过程复杂化[4]。
在确定采用哪种纯化方法时，还应考虑上游工艺产生的典型细胞培养杂质。例如，腺病毒和腺相关病毒(AAV)是一些最广泛研究的载体，从裂解细胞培养物中获得。
这不可避免地将细胞碎片和其他杂质引入到病毒制剂中，这些杂质在产品分离之前需要去除，如宿主细胞DNA和蛋白质、内毒素、外来病毒污染物和病毒-DNA聚集物[5]，这可能会影响安全性和有效性。上游过程还可能导致产生缺乏治疗有效载荷或活性的受损或空病毒颗粒，以及封装错误遗传物质的病毒。下游纯化工艺必须根据特定产品的需要进行调整，同时考虑到上游病毒生产和收集方法所产生的特定病毒的特性和杂质。
传统上，下游病毒纯化方案通常涉及诸如密度梯度超离心等繁琐步骤，虽然这些技术对于原理证明实验已经足够，但难以规模化，可能无法满足治疗产品[6]的严格纯度标准。因此，生物制药行业正在利用色谱在下游工艺中的能力来帮助满足大规模病毒纯化的要求，并实现高病毒回收率[5,6]。

利用色谱法扩大下游工艺

通常，蛋白质纯化的下游过程由最初的蛋白质捕获步骤组成，对于单抗来说，该步骤包括使用蛋白A树脂的亲和层析(AC)，然后是两个抛光步骤，考虑到感兴趣蛋白质的物理化学性质，并有助于在产品分离之前去除任何剩余的杂质。与蛋白质纯化方法类似，可以通过结合基于固定(树脂)相和流动(溶质)相之间不同相互作用模式的步骤来获得最佳的病毒纯化——例如，一个步骤基于病毒粒子电荷，另一个步骤基于其疏水性。
AC可以通过利用病毒表面蛋白基序与特定细胞配体结合的能力，应用于下游病毒纯化过程，从而帮助分离感兴趣的病毒颗粒。这种方法的一个重要限制是用于初始AC捕获的配体是针对现有的血清型的，导致每次出现新的病毒血清型或平台时都需要耗时的配体设计，这使得这种方法不适合大规模的病毒载体和疫苗制造[3]。

离子交换色谱法

离子交换色谱(IEX)是AC的有效替代品，通常用于整个生物制药行业的初始大规模病毒捕获[4,5,6]。离子交换器利用了感兴趣的病毒颗粒和溶液中存在的其他生物分子之间的净表面电荷的差异。例如，核酸总是带负电荷，因为主干中存在电离磷酸基，而病毒的净电荷取决于特定pH值[5]下表面带电氨基酸的比例。

对于带负电荷的逆转录病毒和腺病毒，核酸酶处理原料，然后使用阴离子交换色谱(AEX)树脂(如Nuvia HP-Q)进行单步色谱(例如，Nuvia HP-Q)已被证明是一种有效的大规模捕获步骤，非常适合于临床级病毒载体的生产[4,9]。与阳离子交换剂不同，阴离子交换剂通常在与上游生物反应器进料流一致的pH值和离子强度(盐浓度)条件下结合病毒，从而提高过程的经济性和效率。AEX还可以作为一个抛光步骤，根据细微的电荷差异，帮助分离空病毒衣壳和满病毒衣壳，并去除原料中带负电荷的杂质[8,9]。阳离子交换色谱(CEX)树脂(如Nuvia S)可用于捕获病毒，也常用于抛光步骤，以成功去除大多数与工艺和产品相关的杂质[5,10]。
考虑到病毒颗粒的完整性容易受到环境波动的影响，包括pH值变化、不同的缓冲成分、温度变化和剪切应力，因此设计一个能够以最少步骤达到最高纯度的下游处理平台至关重要，以最大限度地提高质量、效率和安全性。

利用多模态色谱法提高下游工艺效率

多模式(或混合模式)色谱法的出现带来了高选择性介质，旨在简化纯化过程，减少下游处理时间，提高整体工艺经济。混合模式树脂将至少具有两种相互作用模式的配体结合在一起，例如亲和、尺寸排除、离子交换和疏水相互作用。多模态色谱可以优化病毒颗粒的纯化，这将是无效的纯化顺序单模方法。
例如，在单一疏水阳离子交换树脂中结合疏水相互作用和阳离子交换的特性，可以优化重组腺病毒[7]的捕获。具体来说，在捕获步骤中使用疏水阳离子交换树脂(例如Nuvia cPrime)，因为它能最好地清除带负电荷的饲料流污染物(例如动物血清)，并使处理体积减少了十倍。该树脂的洗脱液可以装载到第二个和最后一个阴离子交换柱(例如Nuvia Q)，这导致产品体积减少了两倍，优化产品纯度与临床级产品[7]相当。利用多种相互作用模式，这种两步方法以更具成本和时间效益的方式加强了病毒颗粒与杂质的分离。
类似地，羟基磷灰石色谱(HAC)混合模式介质具有结合广泛病毒颗粒的能力，可有效地用于中间或最终抛光。HAC的混合模式能力可以基于钙亲和力和阳离子交换相互作用分离分子。单步HAC已成功用于包膜(如登革病毒、日本脑炎病毒、流感病毒和小鼠肝炎病毒)和非包膜(如腺病毒、猫杯状病毒和脊髓灰质炎病毒)哺乳动物病毒的分离，从而浓缩制备高活性病毒[11,12]。

结论

随着病毒载体在基因治疗和疫苗开发中的应用不断增长，对更快的产品开发和制造的需求也在不断增长。病毒颗粒物理化学性质的复杂性带来了独特的纯化挑战，特别是在大规模生产环境中。色谱法已经成为一种高度选择性且可靠的可扩展的病毒纯化方法——具体来说，混合模式介质创新可以成为更快、更具成本效益的产品开发和制造背后的驱动力。与单模色谱树脂不同，混合模树脂允许(i)使用其他色谱方法有效分离看起来均匀的分子，(ii)选择性单步去除杂质，(iii)由于设计空间大，建立最佳的结合和洗脱条件，(iv)由于耐盐性强，原料加工最少，以及(v)大容量高滴度进料流[13]。
在下游纯化过程中应用多模态色谱可以显著改善这种治疗方式的制造过程，以帮助满足对安全有效的基因疗法和病毒载体疫苗日益增长的需求。

参考文献

1.全球疫苗市场，https://www.researchandmarkets.com/reports/5576812/global-vaccine-market-size-global-forecast-2022
2.基因治疗市场，https://brandessenceresearch.com/healthcare/gene-therapy-market-global
3.Nestola P等(2015)改进了疫苗和基因治疗的病毒纯化过程。生物技术和生物工程。
4.Fitchmun M，低成本、快速和可扩展的临床阶段逆转录病毒样颗粒下游纯化工艺开发，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_7200.pdf
5.Singh等人(2022)基因治疗病毒载体下游纯化的挑战。化学工程的最新观点。
6.Merten等(2014)病毒载体的制造:第二部分。下游加工和安全方面。医药生物工艺。
7.Fitchmun M等人，腺病毒高效制造工艺的发展，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_6719.pdf
8.Joshi PRH等人(2021)开发了一种可扩展和稳健的AEX方法，用于在血清型5、6、8和9的含基因组VCs中富集rAAV制剂。分子疗法。方法与临床开发。21.341 - 356。
9.快速净化策略- H1N1净化，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_7375.pdf
10.Nuvia™S介质-用于生物分子纯化和下游处理的高容量阳离子交换剂，https://www.bioradiations.com/nuvia-s-media-a-high-capacity-cation-exchanger-for-biomolecule-purification-and-downstream-processing/
11.黑泽明等，利用陶瓷羟基磷灰石纯化哺乳动物病毒，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6549.pdf
12.黑泽明等，用混合模式CHT陶瓷羟基磷灰石XT介质单步纯化流感病毒和登革病毒，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_7115.pdf
13.Scott C(2020)生物制药的混合模式色谱纯化，BioProcess International电子书，https://bioprocessintl.com/sponsored-content/mixed-mode-chromatography-resins-for-purification-of-biopharmaceuticals/