自动样品制备:Hypernation缺少连字符

2022年7月12日

作者:Camilla Liscio，代表Anatune Ltd

免费阅读

文章可以免费下载。解锁文章将显示更多的内容，图表和图像。

1980年，Hirschfeld[1]首次创造了术语“连字符”，以表示色谱分离和一种或多种光谱/光谱检测技术的在线组合。为了充分利用两者的优势，分析界不断需要突破选择性和敏感性的界限，以应对不断增加的挑战和要求更高的分析应用，这推动了这一结合。
近40年过去了，连字符分析技术现在是解决复杂的定性和定量分析问题的首选方法。

为什么会这样呢?
对连字符的偏好可以归结为这种方法可以为分析人员提供的三个关键优势:
•方便:无需样品分馏法，减少仪器和操作时间
•控制:检测可以根据色谱分离进行调整，例如使用分离器板(GC)或分流阀(LC)
•一致性:在线进样和进样全自动化，比人工处理性能更好
随着连字符技术如GC-MS和LC-MS的成熟技术的选择，现在特别关注的系统，其中多个连字符(也称为hypernation)是整个设置的一个组成部分，正如Wilson和Brinkman在2003[2]中所讨论的那样。在超民族的视角下，在线自动化的样品制备发现了它的完美范围，作为一个额外的但极有价值的连字符。事实上，样品制备是任何分析工作流程的重要组成部分，尽管最新可用的连字符技术具有出色的性能，但复杂矩阵的高质量数据只有依靠可靠和可重复的样品制备才能实现。
自动样品制备的附加价值是非常相同的，这是驱动选择的连字符放在首位:方便，控制和一致性。

为什么自动样品制备方便?

让我们以非靶向代谢组学的衍生化和GC-MS分析为例。代谢组学研究特定样本的代谢物组成，这种代谢分析可以通过两种主要方法进行:靶向和非靶向。靶向代谢组学专注于定量预定义的代谢物集合，而非靶向代谢组学提供了全球代谢指纹。在GC-MS代谢组学中，使用最多的衍生化方法是MOX-TMS。这是一个两步的导数化过程。初步的甲氧肟化步骤(MOX)允许羰基反应生成肟。这一步对于防止还原糖的环化、酮烯醇互变异构体的形成和脱羧等过程至关重要，最终范围是降低色谱图的复杂性，因为每个代谢物存在多个峰。连续的硅化反应(TMS)用烷基硅基取代存在于感兴趣分子中的活性氢。硅基化不仅有助于改善分析物的GC色谱性质，而且还增强了质谱性质，为结构阐明提供诊断破碎模式。标准的工作流程需要2小时的样品准备加上40分钟到1小时的GC运行时间。 Noteworthy, TMS derivatives are sensitive to moisture, and they tend to degrade overtime, so it is quite crucial to run the samples freshly derivatised. When using automated sample preparation, it is possible to multitask. Sample preparation for each sample is performed immediately preceding the GC-MS injection whilst the previous sample is running. Figure 1 shows the timeline for the preparation and analysis of 10 samples when using hyphenated and automated sample preparation.
多色带表示样品制备，浅橙色带表示GC运行时间。自动化样品制备不仅提供了一个非常方便的选择，大大减少了操作人员的停机时间，而且还确保及时分析新衍生样品，降低了降解的风险。
图1。当使用连字符和自动样品制备时，10个样品的制备和分析时间轴。
为了支持一个客户的拨款申请，研究真菌内生菌代谢多样性的非靶向方法的全自动化进行了。分析了3种内生真菌(3,11和21)的6个重复，外加3个程序空白，共21个样品。使用几种统计工具对反卷积数据进行处理，以确定三种真菌的关键标记。图2显示了获得的主成分分析图，这是一种有效的可视化方法来探索数据集中的方差，并支持模式识别。这三种真菌和程序性空白在不同的紧密簇中很好地分离。
图2。得到主成分分析图。

为什么自动样品制备是受控的?

SmartSPE®是受控自动化样品制备功能的一个典型例子。事实上，手动SPE的主要限制之一是缺乏流量控制(即著名的“掉落规则”)。这种流量可变性通常转化为绝对采收率可变性。相反，在线SPE的自动化使用ITSP(仪器顶样制备)一次性微型墨盒允许极其精确的流量控制(低至0.1 μ L/s)，这达到了手动方法无法达到的色谱性能。小型化墨盒包装与定制的吸附剂，以匹配标准尺寸SPE墨盒中的材料。它们以96孔的形式出现，由机器人平台通过注射器针头进行处理。在SmartSPE®中，流量剖面遵循预期的Van Deemter曲线，并明确定义了优化[3]，如图3所示。
图3。SmartSPE流量曲线遵循预期的Van Deemter曲线，并具有明确的优化定义。
通过精确的流量控制，>的绝对回收率可达99%，背景矩阵显著减少。在使用离子交换固相萃取时，流量控制的重要性更加重要。事实上，根据Hayward所做的流量优化研究，最佳流量的范围要小得多，如果不能达到最佳流量，采收率可能会急剧下降。智能SPE-GC-MS控制自动化应用于血液中四种法医相关阿片类药物的测定。阿片类药物包括天然和半合成生物碱。它们在罂粟植物中被发现，用于治疗急性疼痛。不幸的是，它们极易上瘾，因此在全球被视为滥用药物。手动工作流程包括初始蛋白质碰撞，阳离子交换SPE以增加分析物浓度并减少基质干扰，然后是蒸发和硅化，然后是GC-MS分析。在本研究中，使用SmartSPE®制备和提取加标血液样本，然后直接注射到GC-MS上。样品批次包括带有内部标准的空白和5个校准器，分别在3天内制备，以评估稳健性和再现性。 Linearity was excellent and error bars showed particularly good inter days variability. Recoveries were above 90% and signal to noise at the lowest calibration point was above 10 for all analytes except for 6-MAM.

为什么自动样品制备是一致的?

一致性是使用数据分析来驱动方法开发和数据挖掘的分析方法的关键要求。因此，自动化与许多有价值的数据分析工具提供了强大的协同作用。实验设计(DoE)是确定影响过程的因素与该过程输出之间关系的系统方法。一旦建立了因素和过程之间的关系，这些信息就可以用来优化响应。必须清楚的是，对这些因素进行持续的控制以将分析可变性降低到最低限度是多么重要。事实上，高分析变异性会掩盖实验空间调查所产生的信息。本例描述了如何使用自动化技术进行实验设计。利用DoE优化了脂肪酸衍生成吡啶酰基衍生物的反应。衍生化通常涉及几个参数的优化，以实现最佳性能，因此它们为DoE提供了一个非常好的环境。传统上，脂肪酸是用甲酯衍生物(FAMEs)进行GC-MS分析的。 However, FAMES mass spectra cannot provide ions indicative of structural features such as double bonds and branch–points. On the other hand, fatty acids picolinyl esters are a better option for structural elucidation. In these derivatives, it’s a nitrogen atom to carry the charge rather than the alkyl chain and this aspect minimises double bonds ionisation and migration, helping to provide very informative structural information. To perform the DoE, four factors were chosen together with their respective range and picolinyl derivatives peak area were chosen as responses. DoE generates a matrix of experiments where trials are run at all possible combinations of all factors settings. The response is recorded for each of the experiments. Using of hyphenated and automated sample preparation makes the experimental side of any DoE conveniently and consistently delivered. As a standard DoE approach, firstly scoping trials were performed to estimate the experimental random variation and evaluate the experimental design space. The scoping trials usually comprise a minimum of four trials: low, where all variables are set at the lowest level, centre points where all variables are set in the middle of the experimental range and high where all variables are set at the highest level. Centre points allow to evaluate for non-linearity and random variation. The pilot trials confirmed significant variability in the experimental space worthwhile to further investigate. Secondly, screening designs were used to differentiate significant factors and find existing interactions between factors. Statistical tools helped with the interpretation of the results. The screening design highlighted a significant effect of temperature suggesting quadratic behaviour. To confirm the trend, an optimisation step was conducted to finalise the relationship between the different factors and the response. Once the optimal conditions were confirmed, the process was run in these conditions in replicates to assess robustness and variability. Figure 4 shows the results for repeatability and reproducibility obtained for a fatty acid mixture C4 to C22.
图4。可重复性和再现性的结果得到了脂肪酸混合物C4到C22
在烷基链范围内可以观察到一定的变异性，但这是可以理解的，因为选择的最佳条件是整个目标反应的最佳妥协。

结论

自动样品制备是一个非常强大的分析工具，它可以在分析工作流程的不同阶段提供非常高性能的几个协同组合。样品制备和方法开发是必不可少的，但极具挑战性的分析方面，可以显著受益于自动化的使用。事实上，自动化的吸引力并不仅仅在于非常好的方法鲁棒性和批对批的可重复性。在液体处理中极其精确的流量控制和准确控制时间的能力(例如，衍生化目的的孵育时间)打开了可以被认为是“高性能”样品制备的大门。方便，控制和一致性确实使连字符自动样品制备缺少连字符任何系统hypernation。