人血清中甲状腺激素的在线固相萃取及LC-MS分析

简介

甲状腺激素在生物过程的调节中起着关键作用，如:生长、代谢、蛋白质合成和大脑发育。具体来说，3,3 '，5,5 ' -四碘- l -甲状腺原氨酸(甲状腺素或T4)和3,3 '，5-三碘- l -甲状腺原氨酸(T3)对于正常生理功能的发育和维持都是必不可少的。对于临床实验室，总T4和总T3的测量，以及游离T4 (FT4)和游离T3 (FT3)的估计，对于甲状腺疾病的诊断和监测是重要的。大多数临床实验室使用免疫测定法测量甲状腺激素，免疫测定法提供了相对快速、高的患者样本通量，这有助于实现自动化，但由于测定干扰和蛋白质水平的变化而影响了游离激素的可用性[1]。

液相色谱质谱法(LC-MS)在血清和组织等生物基质中测定甲状腺激素的特异性和速度优于免疫测定法。然而，报道的样品制备程序通常是液-液萃取然后固相萃取(SPE)，涉及多个耗时步骤，与自动化兼容性较差[2,3]。目前的工作证明了在线固相萃取结合LC-MS从生物基质中快速测定T4, T3和3,3'，5'-三碘- l -甲状腺氨酸(rT3)的成功。

实验

材料:super™Genie C8(结果未显示)和RP-Amide (RPA)在线卡带(2cm × 4.0 mm I.D.)，人血清，蛋白沉淀溶剂:甲醇加1% (w/v)甲酸铵。

样品处理流程:人血清中加入分析物，与沉淀溶剂以1:3的比例涡旋混合沉淀蛋白。然后在10000 x g下离心3 min，收集所得上清直接注入LC-MS分析。

在线SPE-LC-MS设置:6端口开关阀和两个泵;一个用于样品装载和洗涤，另一个用于样品洗脱。为了使潜在的峰从墨盒展宽最小化，样品加载/洗涤和随后的洗脱的流动方向是相反的(图1)。

结果与讨论

传统的(离线)SPE样品制备通常涉及多个劳动密集型和耗时的步骤，包括调节、样品加载、洗涤、洗脱，最后在流动相中蒸发和重建样品。super™Genie RPA在线卡带开发用于自动化样品制备过程，最大限度地减少动手时间和人为错误，并减少总体样品处理时间。图2为RPA在线卡带在人血清中添加T3、rT3和T4的典型LC-MS色谱图。人血清样品用含甲酸铵甲醇沉淀蛋白，离心后直接注射进行在线固相萃取和液相色谱-质谱分析。样品加载/洗涤完全由仪器进行，无需任何手工操作，省去了耗时的溶剂蒸发和重建步骤。

C8和RPA均能捕获人血清中微量的甲状腺激素(100 ng/mL × 2 μL)。三种分析物相互解析，峰宽在半高<6s，尾延因子在1.4-1.8(图2)。总运行时间在6 min内。

总结

建立了一种快速检测人血清中甲状腺激素的在线SPE-LC-MS方法，操作简单，步骤耗时。C8和RP-Amide在线墨盒都能够从蛋白质沉淀的人血清样本中捕获微量的分析物。所有三种分析物，T3, rT3和T4都在联苯柱上被分解，具有尖锐和对称的峰形状。此外，连续120次注射的甲状腺激素保留时间的重现性(%RSD)在0.1% ~ 0.2%之间，峰面积重现性(%RSD)在5.1% ~ 7.7%之间。这些RSD表明在线SPE-LC-MS系统具有很强的坚固性。

参考文献

kahri - janicic N, Soldin SJ, Soldin OP, West T, Gu J, Jonklaas J，串联质谱提高了孕期游离甲状腺素测量的准确性。甲状腺。2007;17(4):303-11。

苏珊S-C。Taia, Lorna T. Sniegoski和Michael J. Welch，使用同位素稀释液相色谱质谱电喷雾电离测定人血清中总甲状腺素的候选参考方法。临床化学，2002;48(4): 637 - 642。

王东丽，用液相色谱-质谱联用技术分析血清中甲状腺激素。《肛门生物与肛门化学》2010;397(5): 1831 - 1839。

全文请访问SigmaAldrich.com/analytix见第四期。