用CG-MALS -非等效多价相互作用分析融合蛋白复合物

定量具有多个结合位点的物种之间的结合亲和力对许多生物物理特征技术提出了重大挑战。成分梯度多角度光散射(CG-MALS)为广泛的相互作用(包括多价相互作用)提供了亲和性和绝对化学计量学的直接测量，而不需要表面固定或标记。
用配体x的两个结合位点构建了融合蛋白模型Y，通过两次CG-MALS实验定量了相互作用。第一个实验量化了X和Y在高亲和结合位点上的相互作用，并提出了第二个低亲和结合位点的存在。基于这些结果的模拟导致了后续实验的设计，以量化较弱结合位点的亲和力，并确认没有形成额外的高阶物种。

生物分子资源设施协会(ABRF)的分子相互作用研究小组(MIRG)开发了两种蛋白质作为研究多价相互作用的模型系统。2012年，这些蛋白质被用于一项基准研究，以测试常见分子相互作用技术的能力。蛋白质X和Y被发送给一组参与者，并通过表面等离子体共振(SPR)分析相互作用，以确定结合亲和力和化学计量学。在SPR实验中给出了固定蛋白Y作为配体的说明，组织者建议采样分析物(蛋白X)浓度为1 nM至300µM。
仅用于说明目的。Binase融合蛋白(多色，pdb1BUJ和pdb2RBI)和两个barstar分子(红色，pdb2HXX)。
该研究结果发表在2013年ABRF Palm Springs年会上[1,2]，结果显示Y蛋白是两个binase突变体(H102Q和R59A/H102Q)的工程融合蛋白。融合蛋白的每个部分都能与一个突变体(Y29A、C40A、C82A)结合，但亲和力差异显著。binase融合蛋白(protein Y)的摩尔质量为26.3 kDa, barstar (protein X)的摩尔质量为11.9 kDa[3]。
用SPR、等温滴定量热法(ITC)和分析超离心法(AUC)进行了广泛的结合研究，以量化每个位点的亲和力(表1)[1,3]。有趣的是，基于“溶液”的测量(ITC和AUC)的亲和力至少比基于表面的SPR强10倍(Kd更低)，这可能是由于与芯片表面的静电相互作用。
表1。总结了用不同的技术测量的barstar与二价barnase融合之间的结合亲和力。
结合亲和力，Kd(µM)
绑定站点1绑定站点2
SPR 0.350±0.140 79±45
Itc 0.008 - 0.034 3 - 17
Auc 0.005 - 0.040 16 - 46

为了使SPR实验指南适用于CG-MALS实验，使用CALYPSOTM软件的模拟工具来确定库存浓度，从而提供广泛的亲和度和化学计量学的定量。与Kd的相互作用范围从10 nM到10µM，在1到4个结合位点之间。根据模拟结果，选择4.8 μ M蛋白质X和800 nM蛋白质Y的储存浓度，使Kd在10 nM到1 μ M之间。该模拟有助于确定较弱的亲和力或复杂的化学计量分析需要第二次实验，其中初始测量的结果用于优化第二次实验的条件。

材料与方法

试剂和仪器
蛋白质X和Y由MIRG基准研究提供，浓度为
分别为9 mg/mL和2.68 mg/mL。所有实验都在乙酸缓冲液(50 mM NH4CH3COO, 100 mM NaCl, 0.1% EDTA, 0.01% NaN3, pH 8.0)中进行，过滤至0.1µm。
蛋白质X和Y之间的相互作用通过成分梯度多角度静态光散射(CG-MALS)进行量化，由Wyatt Calypso®系统自动化。在Calypso中安装0.1 μ m孔径的内联过滤器。蛋白质和缓冲溶液由Calypso输送到UV/Vis浓度检测器(Waters)和DAWN®MALS检测器。
按每个实验指定的原液浓度制备蛋白质溶液，过滤至0.02 μ m，并加载到Calypso上。Calypso制备了不同成分的蛋白质X、蛋白质Y和缓冲液，并根据下面描述的自动化方法将混合溶液输送到MALS和UV探测器。每次注入后，流体停止流动，使相互作用达到平衡。

实验1

蛋白质X和Y分别在运行缓冲液中稀释至~0.05 mg/mL和~0.02 mg/mL (~0.8 μ M和~4.8 μ M)，并在加载到Calypso之前过滤至0.02 μ M。实验由三个成分梯度组成:1)蛋白质Y的浓度梯度，以量化其分子量和任何自相互作用;2)由X和Y的14个成分组成的异质关联(“交叉”梯度)，以确定相互作用亲和力和化学计量性;3)蛋白质X的浓度梯度，以量化其分子量和任何自相互作用(图1，左)。每次注入后，停止流动60秒(单组分梯度)或180秒(交叉梯度)，以使溶液达到平衡。

实验2

在运行缓冲液中分别将蛋白质X和Y稀释至~0.1和~0.4 mg/mL(~30和~3 μ M)，并在加载到Calypso之前过滤至0.02 μ M。该实验由X和Y的9个组成组成的单一异质关联(“交叉”梯度)组成，以确定相互作用亲和力和化学计量(图1，右)。每次注入后，停止流动180秒，使溶液达到平衡。
图1。实验一(左)和实验二(右)的CG-MALS实验设计。

数据分析

对于每个实验，在整个CG-MALS运行过程中收集光散射和紫外线吸收数据。反应动力学相对较快，当混合物进入DAWN流池时，反应似乎处于平衡状态。这导致了相对平坦的平台，在任何组成下都没有缓慢反应动力学的证据(图2)。平衡光散射和浓度数据拟合到适当的模型，使用CALYPSO软件确定相互作用亲和力和化学计量。

结果与讨论

进行了两个CG-MALS实验，以确定蛋白质X和Y之间多价相互作用的亲和性和化学计量学。初始实验在低浓度下进行，定量了在高亲和结合位点上形成的复合物，并在Y上为X检测了可能的第二个低亲和结合位点。并设计了后续实验来确认和量化低亲和结合位点。

初步实验结果及分析

在实验1中，我们收集了X和Y的14种成分的光散射和浓度数据，以量化它们的异质相互作用。乍一看，来自低浓度CG-MALS实验的光散射数据似乎与1:1的化学计量学一致。CG-MALS数据在蛋白质X和Y大约等摩尔浓度时达到最大值。
用1:1模型拟合数据可以得到大约10 nM的绑定亲和力(图3，黑色虚线)。然而，这种拟合稍微低估了X大于y的成分的测量数据。对于大部分异质关联梯度，测量的光散射强度比1:1化学计量法所允许的光散射强度高4%。差异是一致的和相关的，并不是随机误差(图3，底部)。这种更宽的曲率通常表示高阶化学计量。
除了XY复合体之外，还包括X2Y复合体的形成，更好地捕获了测量光散射数据中的曲率(图3，实线红线)。报道的两个结合位点模型的χ²值与一个结合位点模型相比略有改善(分别为0.989和1.16)。此外，对于大多数数据，测量强度与拟合之间的误差小于1%(图3，底部)。
当考虑多价相互作用时，CALYPSO软件不要求每个结合位点的亲和性相等;相反，每个络合物的平衡关联常数是独立确定的。在本实验中，通过拟合多价模型确定的平衡关联常数不支持X在Y上有等效结合位点的假设。
除了异关联交叉梯度外，实验1还单独收集了每种蛋白质的浓度梯度，以分析潜在的自关联。由于测量到的蛋白质X和Y的摩尔质量不随浓度变化(图4)，我们可以得出结论，X在这些条件下不形成可逆二聚体。因此，X2Y化学计量学必须来自蛋白质Y，它含有第二个更弱的x结合位点。将实验1的数据拟合到一个关联模型中，该关联模型允许两个独立的结合位点，估计第二个结合位点的Kd为> 10µM，或比第一个结合位点弱1000倍。

后续实验结果及与其他技术的比较

在实验2中，相互作用是在> 10µM X浓度下测量的。此外，大多数数据是在过量X的条件下收集的，以有利于在两个可能的位点上结合。如图5所示，仅考虑1:1的相互作用显然不能代表测量到的光散射信号(黑色虚线)。最佳拟合(图5，红色)需要XY和X2Y的形成。拟合组合数据集得到解离常数如下:Kd,1 = 10 nM和Kd,2 = 14µM。
CG-MALS结果与已发表的ITC和AUC分析结果一致(表1)[3]。与CG-MALS一样，ITC和AUC都是基于溶液的测量，不会像SPR那样受到表面相互作用引起的伪影。
由于光散射直接测量摩尔质量，CG-MALS作为一种生物物理技术具有额外的优势。如图4所示，可以评估每个结合伙伴的摩尔质量和自相互作用参数，以了解起始材料的寡聚状态。此外，与二次响应(如荧光信号、“共振单元”或反应热)相比，测量的摩尔质量提供了相互作用的清晰读数。最后，可以相对快速地进行CG-MALS实验，实现结合亲和力和化学计量。每个实验在1-2小时内完成(图1)，而类似的AUC定量需要18-24小时[3]。
图5。实验2(高浓度)光散射强度及最佳拟合分析。上图:测量的光散射强度(蓝色圆圈)覆盖了两种不同结合化学计量的最佳拟合曲线。底部:拟合与顶部面板数据相对应的残差。
从最佳拟合模型，CALYPSO软件计算每个物种的浓度在每个组成的梯度。
图6显示了实验1和实验2中每种配合物的摩尔组成。即使在X大于y的情况下，每个结合位点上亲和度的千倍差异也转化为每个复合物浓度的十倍差异。这种确定溶液中每种物质浓度作为组成函数的能力意味着可以进一步优化条件，以偏爱一种结合伙伴而不是另一种;可以避免其他分析方法中可能导致伪影的条件。
图6。实验一(上)和实验二(下)的物种分布。为了清晰起见，未结合单体X和Y的摩尔分数已被省略。

结论

CG-MALS，由Calypso自动化，提供快速，可靠的相互作用亲和力和化学计量学定量。通常，研究人员对两个物种之间的生物学或假定的相互作用有一定的了解。然而，即使情况并非如此，CALYPSO软件模拟工具也可以为开始描述相互作用提供理想的条件。在初始结果的基础上进一步细化，可以为复杂多价相互作用的完整表征提供条件。

确认

我们要感谢MIRG 2012基准研究的组织者提供binase和barstar样本，并将我们纳入研究。

参考文献

1.亚姆纽克，a.p.等人。分子相互作用研究小组(MIRG) 2012基准研究的背景。(2013)。在ABRF 2013年发表。https://abrf.org/sites/default/files/temp/RGs/MIRG/abrf2013-mirgsession1-yamniuk.pdf
2.亚达夫，s.p.等。分子相互作用研究小组(MIRG) 2012基准研究结果。(2013)。在ABRF 2013年发表。https://abrf.org/sites/default/files/temp/RGs/MIRG/abrf2013-mirgsession2-yadav.pdf
3.亚姆纽克，a.p.等人。蛋白质相互作用对模型的开发，作为定量分析2位点蛋白质相互作用的基准工具。j . Biomol。技术26,125-141(2015)。