MALDi组织分型在临床病理研究中的翻译

质谱(MS)成像是一种成熟但仍在发展的技术，用于深入了解一系列样品中分子的空间分布。应用列表继续扩大，但MALDi成像在代谢组学，蛋白质组学，生物标志物发现和最近的临床蛋白质组学领域产生了重大影响。MALDI成像现在被认为是对代谢物、蛋白质、多肽、脂质和聚糖进行无靶向、无标签研究的首选技术，在一次运行中可以成像数千个分子。
虽然有许多用于质谱成像的电离方法，但基质辅助激光解吸/电离(MALDI)已经成为绘制薄样品中分子分布的强大工具。它能够测量从小的代谢物到大的蛋白质的大范围分子，这使得它越来越受欢迎。MALDI成像是唯一能够将检测到的生物标志物详细分配到组织学特征的蛋白质组学技术，使其非常适合将分子信号与临床终点相关，即组织分型，特别是对于癌症等疾病。
尽管有这种潜力，MALDI成像尚未被广泛接受用于临床分析。为了使这项技术成功地从研究平台转移到普遍接受的临床诊断工具，应该建立并遵循标准化的程序。许多疾病是异质的，不仅在患者之间，而且在一个患者组织样本的分子水平上，因此生物标志物的开发依赖于对大样本队列的分析，这反过来又需要高度可重复性的方法。MALDI成像转化为临床病理学有可能推动个性化的治疗方法和改善疾病监测，因此重点转向了这些工作流程的标准化和可重复性。

利用MALDI成像

MALDI成像技术的许多特点使其非常适合临床病理应用。例如，生物标志物发现协议可以利用新鲜冷冻或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片或组织微阵列(tma)。新鲜冷冻组织在大多数常规诊断环境中并不广泛使用，因此FFPE组织通常用于传统的组织病理学应用，因为它们是在医院护理期间常规收集的。因此，FFPE组织的大型组织库收集可用于大型患者队列的临床研究。FFPE标本还保持良好的组织形态，并允许直接收集空间和分子信息。这种组织采集方法的另一个好处是它不需要靶向特异性试剂，如抗体，使得FFPE样本的MALDI成像成为理想的生物标志物发现工具。
在FFPE组织的传统LC-MS/MS分析中，需要大样本量，这在临床环境中是不切实际的。这种方法的样品制备过程也容易丢失空间信息。然而，MALDI成像实验通过在单个完整的组织切片中检测多个分子来保留空间分布。这类实验包括组织分型，即创建组织或临床特定的分子图谱。MALDI成像的无标签和非破坏性特性使其成为保存组织材料以进行后续分析的理想技术，例如癌症活组织检查。
MALDI成像的另一个优点是对组织的直接分析，它不需要耗时的样品均质化步骤——通常会导致样品丢失——而这是克服分子异质性问题所需要的。

标准化临床蛋白质组学

尽管MALDI成像对蛋白质组学分析有好处，但相对较少的大规模研究提供了该技术用于临床应用的可靠性的证据。有必要进行验证研究，以将新标记分子的测量带入临床应用，但不同实验室之间结果的可变性目前限制了其临床应用。为了弥补这一差距，最近的一项可重复性研究调查了不同地理位置的几个实验室是否可以使用标准化样品制备方法和MALDI成像工作流[1]来获得可重复的结果。
开发了用于MALDI成像的原位胰蛋白酶肽消化程序，以保留空间分辨率，同时最大限度地减少准备时间并提高再现性。特异性m/z特征在小鼠肠、人卵巢畸胎瘤和人肺鳞状细胞癌的离散组织学特征中被检测到。使用rapifleX MALDI组织类型仪在FFPE小鼠肠道中定位了两种不同的m/z值，其分布不同(图1A)，当与苏木精和伊红(H&E)染色样品相关时(图2B)，发现m/z 944.6主要定位于肠绒毛和管腔，m/z 1105.6主要定位于隐窝和下层肌肉层。
图1。不同m/z物种在FFPE小鼠肠样品中的空间分布高度保守。A)小鼠小肠概述，m/z 944.6(红色)位于绒毛和管腔，而m/z 1105.6(绿色)主要位于隐窝和肌肉层。比例尺表示1mm。B)测后H&E染色样品。比例尺表示1mm。m/z种(C)和H&E种(D)覆盖层的高倍放大图像(白色虚线框所示区域)证实了上述分布。比例尺为100 μm。转载已得到https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/下参考文献[1]的许可。
尽管已知胰蛋白酶的应用和消化是FFPE样本MALDI成像中空间分辨率变化和损失的来源，但标准化的工作流程可以区分不同组织中的离散组织学特征，使不同的样本位点产生相似质量的图像。
在确认空间分辨率可以保持之后，该研究在多中心调查中检验了MALDI成像结果的可重复性。方法有两个方面:(1)不同的操作员能否在不同的实验室进行相同的实验并获得相似的结果;(2)能否从不同的组织来源获得相似的数据?虽然由于样品之间的固有差异，用户不可能获得相同的结果，但多中心研究发现，最大的变化来源是由于组织内的生物学，而不是取样位置或制备时间和部位。这表明，如果实验室坚持严格的MALDI成像工作流程，可重复性是可能的。超高速的现代MALDI飞行时间(TOF)质谱仪器促进了这一转化到临床研究环境。例如，在这项研究中，一个直径为4毫米的组织样本可以在6分钟内以每秒40像素的采集速率测量。

结合新技术

再现性研究，如所描述的是相关的其他临床病理技术。数字聚合酶链式反应(dPCR)通常用于可靠地检测基因突变，它与MALDI成像的结合在患者分层方面有很大的潜力。一项研究调查了在FFPE组织切片MALDI成像分析后使用dPCR来区分两种主要的非小细胞肺癌(NSCLC)亚型——肺腺癌(ADC)和鳞状细胞癌(SqCC)，以更好地为化疗治疗[2]提供信息。
MALDI成像完成后，用dPCR检测组织样本中已知的表皮生长因子受体(EGFR)突变，用于ADC的分子诊断，以及KRAS原癌基因(KRAS)，这是肺癌中最常见的突变癌基因。结果表明，驱动基因突变可以在以前用MALDI成像分析的样本中检测到。从同一组织切片进行MALDI成像和dPCR分析的能力是非常有利的，因为活检材料通常是有限的。这种蛋白质组学和遗传分析在一个工作流程中的结合是由MALDI成像的非侵入性特性实现的，它已被证明可以通过dPCR等技术保持DNA质量。
除dPCR外，其他研究证实了MALDI成像和免疫组化(IHC)的联合作用。一项实验的结果显示，ADC (m/z 943.53)和SqCC (m/z 1410.62)[3]与特定的峰共定位，这些峰之前已通过MS/MS分析确定为HistoneA2和CK5[4,5,6]。MALDI成像后的免疫组化染色质量足以从感兴趣区域(ROI)进行准确的数据提取和识别感兴趣的细胞。该研究还显示了MALDI成像分析后双IHC染色的可行性，这是一种有用的工具，用于细胞群的亚型，例如来自活组织检查，蛋白质信息可以匹配，而不需要额外的组织损耗。

成像癌症

MALDI成像越来越多地用于区分不同癌症的分子特征。一项回顾性合作研究分析了来自11个国家的252个FFPE临床样本，以确定MALDI成像是否有助于分类非典型spitzooid肿瘤(ASN)[7]。ASN并不是一个明确的诊断，目前不能对病例进行分类，也不能用组织病理学来预测临床行为。样本被分配到四个临床组，研究发现MALDI成像诊断ASN与临床组之间有很强的相关性，提供了比组织病理学更好的预测临床结果。
MALDI成像聚糖是另一种正在研究的方法，以帮助描述和区分癌症。糖基化是一种常见的翻译后修饰(PTM)，可以用MS检测，但几乎没有商业上可用的抗体，使得它们的空间检测几乎不可能。一项研究使用新开发的MALDI成像方法对人类乳腺癌FFPE组织切片和组织微阵列(TMA)[8]中的n -链聚糖进行空间分析。乳腺癌有许多亚型，其生物学特征和临床表现各不相同，根据激素受体和人表皮生长因子受体2 (HER2)的表达状况进行分类。这些亚型的早期特征对于提供及时、适当的治疗至关重要。研究人员可以使用MALDI成像来检测HER2+、三阴性和转移性乳腺癌中多种聚乳酸胺n -聚糖的存在。这些信息可以用来提高对乳腺癌如何发展和传播的理解，为临床生物标志物的开发提供信息，并最终支持诊断、预后和治疗。
另一项研究建立了基于组织的MALDI成像方法，以获得肝细胞癌[9]中n -聚糖的相对丰度和空间分布信息。该方法确定了10个在HCC TMA样本中显著增加的聚糖，可分为两大类:集中化增加的糖和没有集中化但分支增加的糖。希望这些聚糖改变可以用于早期发现HCC并改善治疗方案。

MALDI成像的未来

MALDI成像要在广泛的临床研究应用中实施，包括诊断和预后，它必须能够从不同位置、不同用户和不同组织部位收集的样本中生成可重复的结果。MALDI成像在癌症诊断和治疗中的应用已经得到证明，例如在肺的ADC和SqCC之间的区分，这在以前使用传统的免疫组化技术是具有挑战性的，以及在聚糖成像中使用MALDI。MALDI成像有能力通知研究人员，潜在的，临床医生，潜在的分子事件驱动肿瘤进展和治疗的易感性。可以阐明表型差异，并建立标记来区分其他相同的肿瘤，从而导致更精确的治疗选择和个性化的药物方法。
质谱仪的不断发展，特别是在空间分辨率、灵敏度和样品吞吐量方面的改进，正在为临床研究病理学打开MALDI成像领域。现代先进的质谱仪的速度和鲁棒性允许在具有良好空间分辨率的大型患者队列中快速分析大型标本，这对于推动该技术在诊断、预后和监测治疗反应方面的发展至关重要。多中心可重复性研究强调了高度标准化的样本制备方案和MALDI成像工作流程的必要性和真正的潜力，以建立临床验证和实施所需的数据。
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参考文献

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作者简介

Alice Ly于2010年在墨尔本大学完成了解剖学、糖尿病、神经科学和视网膜的博士学位，并在Helmholtz Zentrum München担任博士后研究助理，在那里她熟悉分子组织分析和最先进的成像技术。她于2016年加入Bruker Daltonics，担任MALDI质谱成像的研究科学家，现在是MALDI组织类型的研发经理。