dia-PASEF:质谱和蛋白质组学的共同进化的结果

质谱(MS)长期以来的技术选择范围的蛋白质组学的应用,和蛋白质科学家是一种强大的工具,生物学家和临床研究者。雷电竞网址持续的发展提高了仪器女士多年来的功能蛋白质组的发现先前未知的部分,最终协助新药的发现,和个人化药物的方法。尽管有这样的发展,蛋白质组的报道仍然是具有挑战性的。检测和定量的蛋白质直接从组织或biofluids预计困难由于大范围的浓度,和蛋白质表达变化取决于遗传和环境两方面的因素。此外,由于可变剪接的,点突变,转录后修饰(天车)和内源性蛋白水解作用,一个给定的蛋白质(基因表达产品)可以表示为许多不同的proteoforms,每个可能都有一个专用的生物活性。

考虑到这些挑战,一个领域的创新MS-based蛋白质组学方法都集中在结合准确、敏感、高通量的蛋白质鉴定和量化,使用自底向上的女士和正交方法。离子迁移谱(IMS)是一个功能强大的分析技术,已广泛应用在过去的五十年,主要在物理化学和分析化学的应用。只有最近的潜力IMS耦合女士(IMS-MS)探讨了分离、识别和量化的多肽和蛋白质。IMS是气相离子分离技术利用机动性的差异通过气体离子在电场的影响下,与巨大的潜力在蛋白质组学的应用程序增加峰容量,动态范围,提高信噪比(S / N)的比例。
有几种类型的IMS,仅扩展女士的功能,如被困离子迁移谱法(蒂姆斯),分离离子被困在一个流动的气流基于非均匀电场对设备的出口增加。蒂姆斯相对较小的设备可以很容易地集成到一个质谱仪离子传输,甚至没有明显损失的增加敏感性[1],增加对复合性格化的信心。

扩大蛋白质组学的可能性

与自上而下的蛋白质组学相比,分析完整的蛋白质碎片的完整的蛋白质,猎枪(或“自底向上”)蛋白质组学分析多肽由蛋白水解消化蛋白质的混合物。猎枪蛋白质组学方法快速生成一个配置文件中许多蛋白质复杂的混合物。蛋白质混合物是由蛋白酶消化,以及由此产生的肽分离的高效液相色谱法(HPLC),其次是串联MS / MS分析产生碎片信息(图1),肽的序列相关。碎片化的信息对于每个肽与蛋白质数据库,搜索匹配的蛋白水解多肽的碎片,从而识别蛋白质蛋白质水解释放的。尽管蛋白质组学技术的最新进展已使MS-based蛋白质组学中央研究工具,全面的蛋白质组报道仍然是难以捉摸的,主要是由于生物样品的复杂性和高动态范围天车的数组。超过10000种蛋白质通常出现在每个生物样品在一个特定的条件和消化后,分析物的复杂性增加了至少两个数量级,因为每个蛋白质生成数十到数百肽[2]。
MS-based蛋白质组学发展的近十年来致力于提高蛋白质组报道的深度和广度,提高数据质量和鉴定的信心,增加必要的样品处理量,使人口规模的蛋白质组测量。尽管各种各样的创新,把这个目标更近,吞吐量和检测灵敏度仍然限制大样本群组研究。最近女士因此关注技术发展速度日益分化没有失去敏感度。
通过合并蒂姆斯设备在前面的四极飞行时间质谱仪(Q-TOF),离子可以累积为一个特定的时间之前被释放为女士分析(图1 b和c)。此外,单独的离子的迁移能力增强敏感性和提供更多的选择性,因为离子由第四个参数——他们的碰撞截面(CCS)。紧凑的离子与一个小CCS漂移速度比延长离子有一个很大的CCS,有效地允许离子由形状[3],以及保留时间、质荷(m / z)比和强度。
蒂姆斯,还使并行积累——串行碎片(PASEF)方法,添加一个额外维度的分离,优越的速度,和对蛋白质组学的敏感性增强工作流。PASEF收购方法——基于使用四极的位置选择肽的m / z,和移动同步迁移洗脱图——利用困离子迁移实现测序速度增加了10倍。测序的增加速度是至关重要的深入研究复杂的蛋白质组,从而在很短的时间内获得定量数据。蒂姆的组合能力和PASEF允许更大的蛋白质组或sub-proteome报道来自小样本卷从复杂的混合物。
图1所示。概述dia-PASEF工作流。(一)肽洗脱色谱柱的电离和通过一个玻璃毛细管进入质谱仪。(B)的双重蒂姆斯分析器、第一蒂姆斯节陷阱和商店离子包,第二通过离子迁移解决它们。(C)离子流动分离离子被释放从第二商旅分析器顺序递减电场强度的函数。(D)、(E) dia-PASEF DIA隔离窗户都耦合到精确的离子迁移相应离子的洗脱。在一个商旅分离多个前体窗口图复制集。[6]。

增加吞吐量与dia-PASEF

CCS,四维空间的分离,显著增加选择性,无论收购战略。数据独立收购(DIA)工作流近年来很流行,因为他们克服随机肽前体的选择问题中遇到典型的数据依赖收购(DDA)方法,从而保证可再生的和准确的蛋白质在大样本人群的识别和量化。DIA产生一个定量回答一个特定的分析物在每个样本,而基于工作流的需要选择单独的前兆。由于不同样本的变化,同一前体可能不会选择在每个银两,意义并不是所有的鉴定肽在一个将与其他运行运行。这就是所谓的“数据完整性问题”,和DIA方法开发来解决这个问题。
在DIA方法,所有离子在给定的m / z窗口是分散在每个运行,原则上允许从运行完整的识别和对比。PASEF原则已经结合新收购的方法称为dia-PASEF DIA,制定新的DIA,达到前所未有的选择性和灵敏度标准肽识别利率与重现量化[7]。DIA方法使用PASEF利用离子迁移和m / z之间的相关性,并使用windows开始高m / z作为更大的物种洗提的蒂姆斯扫描、移动到较低的m / z窗口(图1 d和e)。dia-PASEF窗口方案至少4 x更高效离子利用率比与其他采购方法和DIA,根据样本和窗口方案,以空前的灵敏度可以达到100%的效率。
之前的实验显示超过7000个蛋白质的鉴定单2小时从人类细胞溶解产物[4],和超过8000的可再生的和准确的量化蛋白质的复杂混合物三个蛋白质组[5]。进一步调查的好处dia-PASEF应用到不同的蛋白质组样品不同的复杂性,该方法应用于分析人类癌症细胞系(海拉)和酵母消化,使用不同的梯度长度(30、60和90分钟梯度)。通过耦合DIA隔离windows精确相应的离子,离子迁移洗脱的组合窗口的DIA DIA PASEF原则允许多路复用的窗户在一个100 ms离子流动前体离子的分离。
dia-PASEF方法2在每个100 ms windows dia-PASEF扫描使用。16这些扫描(导致32 windows)介绍了对角扫描线在m / z -离子迁移窗格中确保覆盖双重和三重指控物种狭窄25 m / z隔离窗口(图2)。每个dia-PASEF周期始于一个MS1调查扫描。这个设置会导致总周期时间1.7秒(1 x 100 ms MS1调查扫描,16 x 100 ms dia-PASEF扫描),使足够的数据点得到的色谱峰,同时保持最好的特异性和敏感性。
图2。方法对dia-PASEF方案。应用方法包含两个每个100 ms windows dia-PASEF扫描。16这些扫描封面对角线扫描线双重和三重肽在m / z -离子迁移率平面狭窄25 m / z前体窗口。
四维(4 d)数据处理使用的发展版本Spectronaut (Biognosys AG)、瑞士)。Spectronaut工作流生成光谱库使用综合脉冲星数据库搜索引擎直接从分馏DDA PASEF运行,用于有针对性的数据提取。创建一个特定项目的库从减分次样本。图书馆是由220628个不同的目标肽序列和11578年海拉的目标蛋白质组样品,5127和80874独特的目标肽和靶蛋白组酵母。这些库在Spectronaut用于有针对性的数据提取,包括全自动在运行校准(保留时间、质量和流动性),自动干扰校正,有针对性的分析,自动质量控制。
图3显示了肽序列和蛋白质组标识的数量为90,60岁和30分钟的渐变,凸显出优势的dia-PASEF更深的蛋白质组覆盖和精确量化甚至更短的梯度下降到30分钟。总的来说,海拉和86%的覆盖率达到66%(图3)和酵母(图3 b),分别综合库中的所有蛋白质组的90分钟梯度单身运行没有分离。使用30分钟梯度覆盖海拉仍然实现了55%和79%(图4)和酵母(图4 b),分别。
这项研究的结果表明,优秀的识别利率可以实现对复杂地海拉消化,在90分钟与7600蛋白质组确定梯度使用30分钟梯度时间和近6400。这些识别利率,加上dia-PASEF提供的健壮和可再生的量化,将蛋白质组学领域的更接近实现良好的报道蛋白质组合理的吞吐量。

监测疾病的司机

蛋白质组学进入临床空间中的一个关键挑战是一种由贪婪导致的分析和解释数据的高通量的蛋白质组学工作流。主要数据分析(蛋白质鉴定和定量)与强大的计算技术,可以解决但是自动解释蛋白质组学数据建立“疾病与健康”是具有挑战性的。这种能力需要先进的人工智能(AI)和深度学习算法,这是当前研究的重点努力实现真正的诊断蛋白质组学。
例如,罗斯特实验室多伦多大学的研究人员正在使用dia-PASEF监控人类蛋白质组一个人的一生,和观察机器学习可以用来分析数据。
通过分析大型病人军团这样,偏离可以监测和健康状态的分析与偏差可以量化。这种方法旨在提高对生物系统如何工作的理解,他们如何应对这些偏差,以及信号处理。通过应用这一过程个别病人和病人军团,分子的一个病人可以长期跟踪。这可以用来了解其分子剖面变化随着时间的推移,环境和生活方式的改变,最终使过渡的观察一个健康疾病概要,并使诊断在疾病的早期阶段。
纵向研究病人群体是比较个人的重要分子资料随着时间的推移,而不是人口平均,精密医学方法的进展。介绍了机器学习蛋白质组学和代谢组学研究相对最近,缓解在DIA耗时的步骤越多,如光谱库的生成。
罗斯特实验室早期的实验显示,它有可能预测这些光谱库,这将允许集团矿山DIA数据更有效和直接,不依赖以前的实验证据和测量,通常使用基于块完成。

继续4 d蛋白质组学革命

由于缺失值问题面临着传统的DDA方法,蛋白质组学研究人员转向印度作为一个替代方法,承诺可再生的和准确的量化蛋白质在大样本人群通过消除个人肽离子识别的选择。结合PASEF的内在效率,创建新的收购模式dia-PASEF,移动的概念从最小样本容量确定成千上万的蛋白质变成现实。知道观察到的差异是由于生物变异,而不是差异多肽分析在一个和另一个样本,将允许临床科研人员准确地监测疾病的进展。最近的深度学习在蛋白质组学中的应用现在允许研究人员更有效地挖掘dia-PASEF数据,充分利用方法的提高吞吐量,高效离子利用率,肽快速识别和量化,无与伦比的敏感性。这些先进的技术将继续MS-based蛋白质组学的发展。

有关dia-PASEF的更多信息,请访问:
https://www.bruker.com/products/mass-spectrometry-and-separations/lc-ms/o-tof/timstof-pro.html。

引用

1。苦艾KL,邓小平L,哈米德,德波D和Maxon L(2019)潜在的离子迁移在制药和临床分析。:树林里。Darie c (eds)质谱在生物医学研究的进步。实验医学和生物学的进步,第1140卷。施普林格,可汗。
2。贝克年代(2016)小说四极飞行时间质谱猎枪蛋白质组学,博士论文,学院化学和制药、路德维希-马克西米利安-慕尼黑。
3所示。天使TE,英国Aryal Hengel SM,贝克,凯莉RT,罗宾逊EW和史密斯RD(2012)质量spectrometry-based蛋白质组学:现有的功能和未来的发展方向。化学Soc牧师,41岁(10):3912 - 3928。
4所示。Kaspar-Schoenefeld年代,Meier F,作为广告,弗兰克·米哈,吕贝克M, Raether O,柯林斯B, Aebersold R,罗斯特H和曼,“平行积累——串行碎片结合data-independent收购(diaPASEF)。“AppNote质157,https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8 - pdf docs/separations_massspectrometry/literature/applicationnotes/1869385_lcms - 157 _diapasef_ebook.pdf
5。甘地Kaspar-Schoenefeld年代,马克思K, T, Reiter L, Meier F,作为广告,弗兰克·米哈,吕贝克M, Raether O, Distler U, Tenzer年代,Aebersold R,柯林斯B,罗斯特H和曼M .“diaPASEF: label-free量化的高度复杂的蛋白质组。“AppNote质160年,https://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8 pdf - docs/separations_massspectrometry/literature/applicationnotes/1871458_lcms - 160 _diapasef_label free_quantification_09_2019_ebook.pdf
6。Meier F,作为广告,科赫年代,科赫H,吕贝克M, Krause M, Goedecke N, Decker J,库辛斯T,公园,贝奇N, Hoerning啊,考克斯J,而O和曼M .在线并行积累——串行碎片(PASEF),小说被困离子流动质谱仪。摩尔细胞蛋白质组学,2018;mcp.TIR118.000900。美国生物化学和分子生物学学会©。
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